杜仲甙治療被動吸煙導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的實驗研究

劉月耀 ，張魁忠 ，孫貴才 ，徐 聰 ，吳炳華 ，凌 強

（1.宜黃縣人民醫(yī)院骨科,江西 宜黃 344400；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，南昌 330003）

吸煙是一種對健康十分有害的因素，目前有研究已經(jīng)證實了吸煙不僅可以抑制骨的形成，而且可能直接影響骨量峰值的形成，不同程度的促使骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)生，而且周鋒波發(fā)現(xiàn)不吸煙的OP患病率明顯比吸煙者要低[1-2]。早在20世紀(jì)90年代，就有學(xué)者對杜仲葉的水提取物進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗骨質(zhì)疏松功效[3-4]，最近張賢等[5]也發(fā)現(xiàn)杜仲可有效防治去卵巢大鼠骨量的丟失。本研究觀察杜仲葉提取物中杜仲甙對被動吸煙引起的骨質(zhì)疏松是否有治療效果，為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療和實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲甙（成都瑞芬思生物科技有限公司），SD大鼠（南昌大學(xué)動物實驗中心），堿性磷酸酶試劑盒（南京建成試劑公司），抗酒石酸鹽酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒（大連寶生物公司），雙光子骨密度儀（Lunar PIXImus,GE Medical Systems,WI,USA）

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組并干預(yù)

30只2個月齡SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（211.52±15.66）g，大鼠按隨機數(shù)字表法分成3組，空白對照組、被動吸煙組、杜仲甙治療組，每組10只。1）空白對照組：常規(guī)方法飼養(yǎng)，不給予任何處理；2）被動吸煙組：常規(guī)方法飼養(yǎng)的同時給予被動吸煙；3）杜仲甙治療組：常規(guī)飼養(yǎng)，被動吸煙制造骨質(zhì)疏松模型，給予杜仲甙 300 mg·kg-1·d-1灌胃。被動吸煙組和杜仲甙治療組大鼠按照“密室熏煙”法處理，被動吸煙時移至專供熏煙的實驗室（6 m3），關(guān)閉門窗，空調(diào)通風(fēng)換氣，控制室溫20℃；每天上、下午各煙熏1次，每次同時點燃香煙100支，每只大鼠平均吸煙5支，每次被動吸煙1 h。

1.2.2 骨密度測量

所有實驗大鼠予戊巴比妥鈉麻醉后，進行雙光子骨密度測定（Lunar PIXImus，GE Medical Systems,WI,USA）。選擇動物研究模式測定。分別測量腰椎骨密度、骨容積以及腰椎測量區(qū)域面積。

1.2.3 動物生化學(xué)檢測

動物處理4個月，對所有大鼠在麻醉條件下進行骨密度（bone mineral density，BMD）檢測后，處死大鼠，從實驗動物頸動脈取血后，室溫下低速（500 r·min-1，離心10 min）離心后，小心吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至EP管中，-80℃超低溫冰箱保存。獲取全部標(biāo)本后統(tǒng)一送實驗室采用標(biāo)準(zhǔn)實驗室方法檢測血清磷（P）、鈣（Ca2+）、堿性磷酸酶（ALP）及酸性磷酸酶（ACP）值。

1.2.4 骨質(zhì)疏松模型鼠體質(zhì)量變化

在給予實驗干預(yù)前、干預(yù)結(jié)束后分別對大鼠體質(zhì)量進行測量并記錄，觀察實驗組之間大鼠體質(zhì)量變化情況。

1.2.5 骨組織形態(tài)學(xué)測量

麻醉處死大鼠后，剔除大鼠脛骨周圍軟組織，將近端脛骨置入10%中性福爾馬林液中固定3 d，室溫下用10%EDTA螯合劑脫鈣10 d，隨后逐級濃度梯度乙醇脫水，石蠟包埋。在Leica 2500E型切片機上進行骨組織切片，縱形切片，厚度為10 μm，取中心矢狀面切片進行H.E染色，顯微鏡下攝片。用圖像分析系統(tǒng)對照片進行骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)測量。骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)指標(biāo)如下：1）骨容量百分比（BV/TV）：骨小梁容量（BV）占骨組織容量（TV）的百分比；2）骨小梁厚度（Tb.Th）；3）骨小梁數(shù)量（Tb.N）；4）骨小梁疏密度 （Tb.Sp）。 其中骨小梁厚度（Tb.Th，μm）為骨容量百分比 （BV/TV）除以1/2骨表面積（BS）。Tb.N及Tb.Sp由以下公式計算：Tb.N=(BV/TV)/Tb.Th，Tb.Sp=1/Tb.N－Tb.Th。 測量放大倍數(shù)為×312.5倍。測量區(qū)域為距離骨干骺端生長板最低點0.4 mm以下，距離兩側(cè)骨皮質(zhì)表面0.4 mm以內(nèi)區(qū)域。測量長度為骨干骺端生長板最低點以下2 mm范圍內(nèi)骨小梁。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究結(jié)果測量的數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中多因素方差分析的方法進行統(tǒng)計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 杜仲甙對被動吸煙大鼠體質(zhì)量的作用

在藥物干預(yù)治療前及治療后，分別對大鼠的體質(zhì)量變化進行了統(tǒng)計。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠在實驗后體質(zhì)量比被動吸煙組大鼠要高出32%。這表明吸煙對大鼠體質(zhì)量的減輕具有重要作用。然而，被動吸煙組及杜仲甙治療組大鼠在實驗后的體質(zhì)量相對實驗前分別增長 13%[（129.08-114.13）/114.13×100%]和[（148.36-114.25）/114.25×100%]29%，杜仲甙治療組大鼠體質(zhì)量較被動吸煙組大鼠體質(zhì)量高16%，2 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1），說明杜仲甙對吸煙引起的體質(zhì)量減輕有明顯的治療作用。

表1 各組實驗前后大鼠體質(zhì)量變化的比較 ±s,m/mg

表1 各組實驗前后大鼠體質(zhì)量變化的比較 ±s,m/mg

組別對照組被動吸煙組杜仲甙治療組n 10 10 10 F P實驗前 實驗后114.94±14.18 166.78±28.81 114.13±17.68 129.08±25.82 114.25±15.36 148.36±19.92 13.237 1.582 0.638 0.000

2.2 杜仲甙對被動吸煙大鼠骨密度的作用

實驗后被動吸煙組大鼠骨密度值 （0.171±0.085）g·cm-2較對照組（0.223±0.033） g·cm-2明顯下降，說明被動吸煙能夠明顯引起大鼠骨質(zhì)疏松。杜仲甙治療組大鼠的骨密度值 （0.209±0.029）g·cm-2明顯較吸煙組骨密度值（0.171±0.085 ）g·cm-2提高，與吸煙組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但是與對照組骨密度值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，杜仲甙治療組大鼠骨容積數(shù)值較吸煙組明顯增加（P＜0.05）（表2）。

表2 各組骨密度參數(shù)的比較 ±s

表2 各組骨密度參數(shù)的比較 ±s

組別n 骨密度P/（g·cm-2）骨容積V/（m3·kg-1）骨面積A/cm2對照組被動吸煙組杜仲甙治療組10 10 10 F P 0.223±0.033 0.171±0.085 0.209±0.029 2.361 0.008 0.486±0.067 0.375±0.042 0.458±0.065 3.128 0.026 2.180±0.082 2.196±0.079 2.188±0.072 11.769 0.835

2.3 杜仲甙對被動吸煙大鼠血生化指標(biāo)的作用

對照組、被動吸煙組、杜仲甙治療組血清鈣的濃度之間無統(tǒng)計學(xué)差異，但是被動吸煙組血清鈣濃度平均值較對照組和杜仲甙治療組更低。被動吸煙組大鼠血清磷（P）和堿性磷酸酶（ALP）水平較對照組 分 別 高 出 52.27%[（2.01-1.32）/1.32×100% ] 和51.78%[（88.29-58.17）/58.17×100%]。 杜仲甙治療組的堿性磷酸酶水平與對照組和被動吸煙組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；被動吸煙組的血清酸性磷酸酶（ACP）水平較對照組明顯增高（P＜0.05），杜仲甙治療組與對照組的血清酸性磷酸酶水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 3），表明杜仲甙能明顯下降酸性磷酸酶活性。杜仲甙治療組堿性磷酸酶較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明杜仲甙能明顯增加堿性磷酸酶活性。

表3 各組血液生化檢測的比較 ±s

表3 各組血液生化檢測的比較 ±s

組別對照組n被動吸煙組杜仲甙治療組10 10 10 F P Ca2+ρ/（mg·dL-1）2.46±0.13 2.35±0.15 2.41±0.12 18.726 0.000 ρ/（mg·dL-1）1.32±0.30 2.01±0.65 1.19±0.28 3.017 0.032 ALP ρ/（pg·mL-1）ACP ρ/（pg·mL-1）58.17±14.87 13.52±2.62 88.29±21.81 16.03±2.55 143.26±38.51 14.86±2.73 0.847 2.351 0.000 0.028

2.4 杜仲甙對被動吸煙大鼠形態(tài)學(xué)的作用

如封四圖1B所示，吸煙組大鼠骨組織切片顯示骨質(zhì)破壞明顯，骨小梁稀疏、變薄。對照組及杜仲甙治療組則可見骨容量明顯更高，杜仲甙治療組骨質(zhì)破壞、溶解現(xiàn)象較吸煙組明顯少。而且，杜仲甙治療組組骨容量百分比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th為骨容量百分比（BV/TV）除以1/2骨表面積（BS）及骨小梁數(shù)量（Tb.N= （BV/TV）/Tb.Th）等參數(shù)指標(biāo)值較吸煙術(shù)組明顯提高（P＜0.05），而骨小梁疏密度（Tb.Sp=1/Tb.N － Tb.Th）指標(biāo)值是明顯下降的（P＜0.05）（封四圖1C；表4）。結(jié)合骨密度及骨容積數(shù)據(jù)，提示杜仲甙對被動吸煙引起大鼠骨質(zhì)疏松的骨丟失具有直接保護作用。

表4 杜仲甙對骨質(zhì)疏松治療的形態(tài)學(xué)參數(shù) ±s

表4 杜仲甙對骨質(zhì)疏松治療的形態(tài)學(xué)參數(shù) ±s

組別n 骨小梁數(shù)量/（個·μm-2）對照組被動吸煙組杜鐘甙治療組10 10 10 F P骨容量百分比/%38.69±3.11 24.83±3.56 32.28±1.69 15.718 0.000骨小梁厚度d/μm 85.56±1.59 76.05±6.36 80.92±1.97 3.652 0.087骨小梁疏密度0.47±0.04152.08±23.55 0.36±0.39223.57±35.97 0.41±0.25168.37±14.62 9.667 12.565 0.000 0.000

3 討論

3.1 被動吸煙和主動吸煙均能夠明顯導(dǎo)致骨質(zhì)疏松

A.Bush等[6]發(fā)現(xiàn)吸煙組BMD比非吸煙組低，大量吸煙組中BMD、骨強度指標(biāo)與非吸煙組相比差異更為顯著。最近研究[7]證明吸煙組腰椎正位總體、髖部總體、股骨頸與Ward’s區(qū)BMD顯著低于非吸煙組。吸煙組股骨遠端體積/總體積比及骨小梁厚度均顯著低于對照組[8]。A.Afghan 等[9]研究證實了被動吸煙女性骨質(zhì)疏松患病率是不吸煙家庭3倍，同時她們中脆性骨折史也是后者的2.6倍。王溪原等[10]研究也發(fā)現(xiàn)被動吸煙絕經(jīng)女性股骨大部分骨密度指標(biāo)和抗骨折能力數(shù)據(jù)明顯低于不吸煙組；認(rèn)為不管是主動吸煙行為，還是被動吸煙行為對絕經(jīng)女性骨密度和骨強度指標(biāo)損害是類似的。被動吸煙者暴露在煙霧中僅僅30 min，他們血液流變學(xué)功能指標(biāo)改變就與經(jīng)常主動吸煙者區(qū)別不明顯，至少在短期內(nèi)是這樣。這些證據(jù)直接說明了被動吸煙同樣能夠?qū)Σ晃鼰熣呱眢w的各個系統(tǒng)造成有害影響[11]。所以本實驗選擇了被動吸煙的形式制造骨質(zhì)疏松模型，本方法簡便易行而且有效。本研究發(fā)現(xiàn)，被動吸煙組大鼠的體質(zhì)量在研究前3組無差異，在研究后3組的體質(zhì)量明顯有差異，而且被動吸煙組比對照組和杜仲甙治療組明顯減輕，說明吸煙明顯能影響大鼠體質(zhì)量的正常增加，同時也說明被動吸煙可以引起全身各個系統(tǒng)的損害。

骨組織是由有機基質(zhì)和無機礦物質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)由成骨細胞分泌，經(jīng)礦化后為骨骼提供支架，骨基質(zhì)協(xié)調(diào)成骨細胞及破骨細胞的代謝從而儲存離子和生長因子；礦物質(zhì)由鈣羥基磷灰石晶體和鈣磷混合物構(gòu)成。骨礦化過程中，鈣離子由組織細胞提供或由經(jīng)消化系統(tǒng)吸收入血循環(huán)的鈣提供，其中50%與血漿蛋白相結(jié)合，從而保持游離鈣離子濃度低于溶液中形成磷酸鹽水平。磷離子來源于代謝物質(zhì)焦磷酸的裂解,然后再與磷脂或磷脂蛋白相結(jié)合,構(gòu)成循環(huán)中的磷離子。ALP是成骨細胞的一種外酶，在成骨過程中ALP水解膦酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必需的磷酸，進基質(zhì)礦化。血漿抗酒石酸鹽酸性磷酸酶（sTRACP）是由多核破骨細胞（OC）釋放，具有很高吸收功能活性，是破骨細胞功能的重要標(biāo)志。血液中TRAP主要來源于骨吸收過程中破骨細胞的釋放，TRAP的活性與骨吸收狀況相平行,不受膳食、運動和年齡的影響。

為了證明被動吸煙是否能夠引起骨質(zhì)疏松，本研究檢測了被動吸煙組與對照組之間骨密度、血清鈣、血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、形態(tài)學(xué)改變等指標(biāo)。無論從間接形態(tài)學(xué)參數(shù)（表2、表4）還是直接形態(tài)學(xué)（圖1）檢測均發(fā)現(xiàn)吸煙組中平均骨密度較對照組顯著下降；血清中鈣濃度較對照組明顯下降、酸性磷酸酶濃度較對照組顯著升高（表3），說明被動吸煙組中骨吸收較骨形成更強，打破了骨的代謝平衡，從而形成了骨密度下降。

3.2 杜仲甙明顯改善被動吸煙引起的骨質(zhì)疏松

目前臨床上治療OP的藥物基本以雙磷酸鹽、鈣制劑等為主，長期服用可產(chǎn)生依賴性和不良反應(yīng)[12]。治療OP的藥物大多數(shù)是骨吸收的抑制劑，少數(shù)藥物能促進骨形成，具有雙重功效的藥物缺乏。藥理研究[13]表明，杜仲提取物對成骨細胞有增殖作用，對破骨細胞有抑制作用。杜仲可增加去卵巢大鼠體內(nèi)E2含量，降低體內(nèi)骨鈣素（BGP）及尿羥脯氨酸（HOP）含量，增強去卵巢大鼠腰椎骨密度及提高脛骨抗彎曲力[5]。本研究表明杜仲甙治療組中骨骨密度與被動吸煙組比較有顯著性差異（表2）；從形態(tài)學(xué)分析，與被動吸煙組比較能夠明顯增加骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨容量百分比，減少骨小梁疏密度（圖1，表4）；從生化水平分析，與被動吸煙組比較，杜仲甙治療組能夠明顯增加堿性磷酸酶濃度，減少酸性磷酸酶濃度（表3）。血清AKP是通過分解磷酸酶，增加局部無機磷的濃度，從而促進骨基質(zhì)的鈣化。而杜仲甙治療后，血清AKP含量最高，結(jié)果提示杜仲甙能顯著地提高成骨細胞活性，使骨形成活動增強；同時杜仲甙能明顯抑制減少酸性磷酸酶濃度，從而抑制骨的吸收作用。這些數(shù)據(jù)表明杜仲甙既能促進成骨，又能減少骨吸收，從而明顯改善吸煙引起的骨質(zhì)疏松。

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲藥效為“補中，益精氣，堅筋骨……久服輕身耐老”。杜仲主要功能為補腎、強筋健骨，中醫(yī)藥治療通過補腎治療骨質(zhì)疏松的臨床研究已經(jīng)取得了較好的臨床療效，逐漸受到人們的重視。唐寶平[14]認(rèn)為全杜仲膠囊治療骨質(zhì)疏松療效顯著，值得臨床推廣。本研究從基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)杜仲甙在生化水平能促進堿性磷酸酶濃度增加，降低酸性磷酸酶濃度；從形態(tài)學(xué)研究明顯改善骨質(zhì)疏松骨的密度，從而能夠治療吸煙引起的骨質(zhì)疏松，為杜仲治療骨質(zhì)疏松提供了實驗依據(jù)，同時也為杜仲治療骨質(zhì)疏松提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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