不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響

王志學(xué) 孫立新 李汝泓 雷 燕 于鐵莉 邱利飛 閆彩云

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北 承德 067000)

由于手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及免疫治療等綜合治療措施的實(shí)施，乳腺癌病人的死亡率開始下降，生存期得以延長。但是乳腺癌患者中疼痛的發(fā)生占有很大的比例，因此解除或減緩癌癥病人的疼痛是一項(xiàng)重要的任務(wù)，嗎啡(Morphine)作為阿片類藥物的一種，目前仍然是癌痛治療的主要手段。近年來人們發(fā)現(xiàn)，嗎啡在鎮(zhèn)痛的同時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞的增殖和凋亡，主要通過阻滯細(xì)胞周期(抑制細(xì)胞周期G1→S期進(jìn)展)、誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達(dá)、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)敏感性而發(fā)揮抑癌活性〔1～3〕。但由于癌癥病人的疼痛治療往往不是單獨(dú)實(shí)施，常與癌癥病人的化療同時(shí)進(jìn)行，而嗎啡與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抗癌效果的影響尚未見報(bào)道。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是各期乳腺癌的基礎(chǔ)化療藥物，目前仍廣泛應(yīng)用于臨床一線。因此，本研究以5-Fu為代表，研究嗎啡與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Annexin V-EGFP，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胎牛血清，天津血液學(xué)研究所;RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCO BRL公司;胰蛋白酶，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司;碘化丙啶，美國Sigma公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國B＆D公司;YT-CJ-1N超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心;CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;LD5-IA低速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS;熒光倒置顯微鏡，日本尼康。

1.1.2 藥物 嗎啡注射液，東北制藥集團(tuán)公司;5-Fu注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 MCF-7乳腺癌細(xì)胞，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇成功后，調(diào)整濃度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。觀察待貼壁70% ～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 分組 共分為8組，分別用含不同藥物的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。N組(對(duì)照組)為非藥物處理組，LM組為50μmol/L嗎啡處理組，MM組為250μmol/L嗎啡處理組，HM組為1 250μmol/L嗎啡處理組，F(xiàn)組為500μmol/L 5-Fu處理組，LM+F組為50μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組，MM+F組為250μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組，HM+F組為1 250μmol/L嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組。

1.2.3 FCM檢測(cè)Annexin V-EGFP/PI染色的細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約5×105/ml，傳至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，共32瓶。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)分組情況更換為含不同藥物的培養(yǎng)液5 ml，每組4瓶，分別孵育48 h。吸棄上清，消化、PBS洗滌，收集細(xì)胞(約106/ml以上)于離心管;4℃低速離心(1 500 r/min、5 min)后棄上清，重懸于 500μl的Binding Bufferr溶液，加入 5 μl Annexin V-EGFP 及5 μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min;1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期 另取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種、培養(yǎng)、藥物處理、分組標(biāo)識(shí)、細(xì)胞收集同1.2.3;每管加75%酒精4 ml，4℃固定 24 h;4℃低速離心(1 500 r/min、5 min)，徹底去除酒精;PBS洗滌，震蕩，PI染色，室溫避光放置30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)資料以x±s表示。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)與析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡、5-Fu及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響 單獨(dú)應(yīng)用嗎啡處理48 h，早期凋亡率隨著嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.05，P＜0.01)，濃度為250及1 250μmol/L時(shí)，早期凋亡率〔(3.660±0.606)%，(5.343±0.625)%〕較未處理組〔(1.595±0.620)%〕明顯增加(P＜0.01)，表明 250及1 250μmol/L濃度的嗎啡能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，且嗎啡對(duì)MCF-7細(xì)胞早期凋亡的劑量依賴關(guān)系已經(jīng)顯現(xiàn)。50μmol/L時(shí)，早期凋亡率〔(2.350±0.550)%〕與未處理組比較無顯著性差異(P＞0.05)。不同濃度嗎啡與5-Fu聯(lián)合用藥時(shí)，早期凋亡率隨著聯(lián)合用藥中嗎啡濃度的增加依次增加〔(8.793±0.975)%，(12.545±1.008)%，(17.245±0.806)%，P＜0.01〕。三組嗎啡與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用，均具有協(xié)同作用(P＜0.05，P ＜0.01)。見圖1。

圖1 培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡率

圖2 培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期

2.2 嗎啡、5-Fu及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響 見圖2。單獨(dú)應(yīng)用嗎啡處理時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.01)，而G2M期細(xì)胞比例無明顯變化(P＞0.05)，表明嗎啡可以劑量依賴地誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞主要被阻滯于G0/G1期。單獨(dú)應(yīng)用500μmol/L 5-Fu處理時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例減少(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例增加(P＜0.01)，G2M期細(xì)胞比例減少(P＜0.05)，表明5-Fu可以使細(xì)胞循環(huán)周期主要被阻滯于S期。不同濃度的嗎啡與5-Fu聯(lián)合用藥時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例隨著聯(lián)合用藥中嗎啡濃度的增加依次增加(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨(dú)處理組均減少(P＜0.01);S期細(xì)胞比例隨著嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨(dú)處理組均增加(P＜0.01);G2M期細(xì)胞比例隨著聯(lián)合用藥中嗎啡濃度的增加依次降低(P＜0.05，P＜0.01)，較該濃度的嗎啡單獨(dú)處理組均減少(P＜0.01);三組嗎啡與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用，均具有協(xié)同作用(P＜0.01)。表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用既抑制了G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)化，又抑制了S期向G2M期的轉(zhuǎn)化，也與其中嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關(guān)系。見表1。

表1 不同藥物處理48 h后對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響(x ± s，n=4，%)

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中主要起負(fù)調(diào)控作用，可以遏制腫瘤細(xì)胞迅速生長〔4〕。近年來的共識(shí)是，細(xì)胞凋亡的抑制比細(xì)胞過度增殖在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中所起的作用更重要〔4，5〕。因此針對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡失衡對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行干預(yù)性調(diào)節(jié)，提高細(xì)胞凋亡/增殖的比值就不失為一種腫瘤治療策略，大多數(shù)抗腫瘤藥物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮它們的抗腫瘤效應(yīng)〔6〕。

本文采用此種Annexin V＆PI雙染法，可有效地對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量檢測(cè)，靈敏度高，并可區(qū)分壞死細(xì)胞〔7〕。本實(shí)驗(yàn)中選取作用48 h時(shí)檢測(cè)。單獨(dú)應(yīng)用不同濃度嗎啡處理時(shí)，嗎啡濃度為50μmol/L時(shí)，尚不能證明細(xì)胞凋亡率增加，其他各處理組的細(xì)胞早期凋亡率均有明顯增加，并且隨著嗎啡濃度的提高，有明顯的濃度依賴關(guān)系;單獨(dú)應(yīng)用500μmol/L 5-Fu，早期凋亡率也顯著增加;各濃度嗎啡與500μmol/L 5-Fu兩藥聯(lián)合應(yīng)用情況下，早期凋亡率亦均顯著增加，并且隨著其中嗎啡濃度的增加呈現(xiàn)明顯濃度依賴關(guān)系。經(jīng)過析因設(shè)計(jì)方差分析，各濃度嗎啡與500μmol/L 5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)早期凋亡率增加均具有協(xié)同作用。

臨床上在應(yīng)用嗎啡癌痛治療時(shí)，常常是一個(gè)劑量逐步增長的長期用藥過程。在慢性長期用藥或相對(duì)高濃度時(shí)(＞250μmol/L持續(xù)用藥48 h以上;50～250μmol/L或作用更短時(shí)間也可能有效，但本研究沒能進(jìn)一步證明)，嗎啡會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。在使用化療藥5-Fu(其他化療藥有待研究)化療過程中，一定濃度以上的嗎啡(＞50μmol/L持續(xù)用藥48 h以上，0～50μmol/L或作用更短時(shí)間有待研究)會(huì)顯著強(qiáng)化5-Fu誘導(dǎo)的增殖抑制和細(xì)胞凋亡。雖然臨床上目前尚未證實(shí)阿片類藥物對(duì)化療病人的轉(zhuǎn)歸有何影響，但是從協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡這一角度，嗎啡應(yīng)用的益處并不僅限于止痛。但基于離體實(shí)驗(yàn)之局限性，確切臨床效果還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期受阻密切相關(guān)。一個(gè)親代細(xì)胞依次經(jīng)歷分裂間期和分裂期后，形成兩個(gè)遺傳物質(zhì)完全相同的子代細(xì)胞，完成其增殖過程〔8，9〕。在惡性腫瘤細(xì)胞群體中一部分處于活性增殖狀態(tài)，另外的細(xì)胞則會(huì)停滯在靜止期(G0期)〔10〕。周期素(cyclin)和周期素依賴性激酶(Cdks)復(fù)合物作為細(xì)胞周期的“發(fā)動(dòng)機(jī)”，驅(qū)動(dòng)著細(xì)胞有條不紊地依次經(jīng)過G1→S→G2→M期，完成其增殖過程。而細(xì)胞周期調(diào)控的異常將導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，增殖失控，最終發(fā)生癌變，是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)〔11〕。

細(xì)胞分裂和DNA合成是細(xì)胞周期的兩個(gè)主要事件，細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制，最終必然通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期各階段的DNA含量來實(shí)現(xiàn)。流式細(xì)胞儀就是通過測(cè)定細(xì)胞DNA的含量檢測(cè)細(xì)胞周期的〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嗎啡可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞主要被阻滯于G0/G1期，并且這種細(xì)胞周期阻滯存在劑量依賴性，即隨著嗎啡劑量的逐漸增加，G0/G1期的細(xì)胞比例也隨之逐漸增加，S期細(xì)胞逐漸減少，G2M期細(xì)胞比例基本不變。這說明嗎啡抑制了MCF-7乳腺癌細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致了G1期阻滯。G1期是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的主要階段，也易接受外界因子的影響。G1期末有一個(gè)限制點(diǎn)特定時(shí)期，在細(xì)胞外條件適宜的情況下，細(xì)胞一旦通過限制點(diǎn)，即便撤去刺激生長和分裂的外界信號(hào)，仍能沿著細(xì)胞周期向前運(yùn)轉(zhuǎn)，成為一個(gè)自主過程直至完成細(xì)胞分裂。而在不適于分裂增殖的細(xì)胞外條件下，細(xì)胞會(huì)延長停留在G1期，甚至?xí)簳r(shí)退出細(xì)胞周期，進(jìn)入G0期。嗎啡處理后能使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，引起細(xì)胞DNA合成減少，增殖受到抑制，阻滯在G0/G1期的細(xì)胞一旦進(jìn)入細(xì)胞周期，則可引起周期基因不適當(dāng)?shù)幕罨?，不是?dǎo)致增殖，反而誘導(dǎo)凋亡〔13〕。

5-Fu的主要作用靶點(diǎn)是DNA，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏っ撗鹾塑账?5-FdUTP)后，與胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)特異性結(jié)合，干擾了細(xì)胞DNA的合成。DNA損傷嚴(yán)重不能被修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)時(shí)，細(xì)胞便進(jìn)行下一事件——凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔14，15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-Fu可以促進(jìn) MCF-7細(xì)胞從 G1期到S期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞循環(huán)周期主要被阻滯于S期。并且，由于細(xì)胞周期被抑制，使處于分裂期的細(xì)胞(G2/M)比例顯著減少。這也再次證實(shí)了5-Fu是細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于S期，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上反映的更為明顯。

兩藥聯(lián)合使用后，既抑制了G1期到S期的轉(zhuǎn)化，又抑制了S期向G2M期的轉(zhuǎn)化，這種協(xié)同作用與嗎啡造成G0/G1期阻滯和5-Fu致S期阻滯有關(guān)，使處于G2M的細(xì)胞比例顯著減少。并且這種細(xì)胞周期阻滯存在劑量依賴性，即隨著聯(lián)合用藥中嗎啡劑量的逐漸增加，G0/G1期的細(xì)胞比例也隨之逐漸增加，G2M的細(xì)胞比例逐漸減少，S期細(xì)胞組間有減少趨勢(shì)。這種結(jié)果當(dāng)然是兩藥分別影響細(xì)胞周期聯(lián)合作用的體現(xiàn)，也正與細(xì)胞凋亡率的變化相吻合。

本研究中嗎啡、5-Fu作用于乳腺癌細(xì)胞，通過影響細(xì)胞周期可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的分子靶點(diǎn)，例如控制細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)化的cyclinD/Cdk4，6 cyclinE/Cdk2，通過S期的過程需要的cyclinA/Cdk2，cyclinB/Cdk1…… 這些分子靶點(diǎn)可以作為腫瘤治療的基礎(chǔ)〔16～18〕。嗎啡、5-Fu調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機(jī)制如何，及其相關(guān)的酶、蛋白之間的相互作用都有待于進(jìn)一步研究。

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