從生豬中分離小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病原學研究＊

穆玉姣，趙嘉詠，郭曉醇，羅 琦，景懷琦，夏勝利

2.登封市防疫站，鄭州 452470；

3.中牟縣防疫站，鄭州 451450；

4.中國疾控中心傳染病預防控制所，北京 102206

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersiniaenterocolitica）廣泛分布于自然界多種動物，家畜家禽帶菌率較高。人類與受感染的家禽家畜接觸，或動物糞便污染水源、食品，均可造成散發(fā)感染甚至疫情暴發(fā)。20世紀80年代曾發(fā)生2次暴發(fā)流行，造成500余人感染［1］。由于該菌嗜冷性的特點，冰箱保存的肉類及肉制品也可能成為傳染源，造成小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病的食源性傳播。為了研究本地區(qū)豬咽拭子（扁桃體）攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌情況，根據(jù)實際工作經(jīng)驗，春秋兩季在我省登封市生豬屠宰場采集豬咽拭子進行該病原菌的分離，并對分離到的菌株進行生化鑒定、生物分型、血清分型和毒力基因的檢測，分析我省生豬攜帶該菌的病原學特征，為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染性腹瀉病的預防控制工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2011年采集河南省登封市生豬屠宰場豬的咽拭子1 346份，屠宰場生豬來源于登封市周邊農(nóng)戶散養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基及配套抗生素為美國BD公司產(chǎn)品，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水 （p H7.4，改良 PBS）、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、動力吲哚尿素培養(yǎng)基（MIU）均購自上海CDC，哥倫比亞營養(yǎng)瓊脂購自英國Oxoid公司。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型血清購自日本生研株式會社（包括O∶1，2；O∶3；O∶5；O∶8；O∶9），菌株鑒定用API20E生化板條及配套試劑均系購自法國生物梅里埃公司，PCR擴增相關(guān)試劑及引物合成來自上海生工，PCR熱循環(huán)儀、電泳儀、凝膠成像儀均為美國Bio－Bad公司產(chǎn)品。

1.3 菌株分離培養(yǎng) 將采集的標本接種于10 m L改良PBS中，4℃冷增菌，分別于第7、14、21 d接種耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24～36 h，挑取疑似菌落轉(zhuǎn)種克氏雙糖斜面25℃培養(yǎng)24 h，選擇克氏雙糖＋/＋、不產(chǎn)氣25 H2S－，接種于尿素培養(yǎng)基及半固體培養(yǎng)基，選擇尿素酶＋、25℃培養(yǎng)動力＋、37℃培養(yǎng)動力－，鏡檢為革蘭陰性桿菌或橢或球桿菌細菌者，使用API 20E生化板條做系統(tǒng)生化鑒定。

1.4 生物分型 參照文獻［2］的生物分型方法進行。

1.5 血清學分型 生化鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株進行血清學分型，并設(shè)鹽水對照。

1.6 DNA模板制備 使用天根細菌DNA抽提試劑盒提取DNA。具體操作按說明書進行。

1.7 毒力相關(guān)基因檢測 PCR［3］檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌粘附侵襲點基因（ail）、耐熱性腸毒素基因（yst A）、生物1A型攜帶的腸毒素基因（yst B）、粘附素（yad A）、yop調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)錄活化作用因子（vir F）。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離（170 V，30 min）。引物序列見表1。

表1 各檢測基因PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplification of primer sequence for Yersinia enterocolitica virulence factors

2 結(jié) 果

2.1 標本檢出情況 1 346份生豬咽拭子中共分離出331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，檢出率為24.59%。

2.2 生物分型及血清學分型結(jié)果 331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)API20E生化鑒定板條鑒定與生物分型主要分為3個生物型：1A型、3型和4型；由于日本生研的血清類型有限，331株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中只能鑒定出O∶3、O∶5、O∶8這3種血清型（部分菌株與所分型血清均未發(fā)生凝集反應，暫定為血清未確定株），其所占比例分別為84.6%（280/331）、2.1%（7/331）、1.8%（38/331）；其中血清型 O∶3均為生物3、4型。結(jié)果見表2。

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 對331株分離的菌株進行ail、yst A、yst B、yad A和vir F 5種毒力基因檢測，結(jié)果見表3。其毒力基因分布特征為：ail＋、yst A＋、yst B－、yad A＋、vir F＋占80.67%（267/331），ail＋、yst A＋、ystB－、yad A－、vir F－占3.32℅（11/331）且均為血清型O∶3；其它型的占16.01%（53/331）。

表2 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型及血清分型情況Tab.2 Biological typing and serotyping of Yersinia enterocolitica isolates

3 討 論

有研究表明小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在豬中尤其是豬咽拭子中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離率較高［4］，本次試驗用無菌棉簽采集生豬屠宰場豬扁桃體為研究對象，進行病原學分析。對1 346份生豬咽拭子分離培養(yǎng)結(jié)果顯示：血清型主要以O(shè)∶3居多，占84.59%（280/331），均為生物3型和4型；未確定血清型的菌株大多為1A型。目前研究認為，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌根據(jù)生化反應可分為6個生物型：1A、1B、2、3、4、5型，生物1A 型菌株均屬于非致病型，而生物1B、2、3、4、5型中大多數(shù)為致病性菌株［5］，我們結(jié)果與國內(nèi)其它報道基本一致［5－6］。

目前認為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因主要包括：位于染色體上的毒力基因ail、yst A；位于質(zhì)粒上的基因yad A和vir F，后者是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病所必須的。ystB編碼一種類似于Yst A的耐熱性腸毒素，它僅存在于生物1A型的菌株中，不具備感染特征。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病力主要與分布在染色體和70 kb質(zhì)粒編碼的毒力因子有關(guān)，并且只有在染色體和質(zhì)粒編碼的各種致病因子協(xié)同作用下，才能使菌株突破宿主免疫，造成感染［7］。通過PCR方法對所分離菌株進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)主要血清型 O∶3菌株的毒力基因是ail＋、yst A＋、yst B－、yad A＋、vir F＋，而 ail＋、yst A＋、yst B－、yad A－、vir F－是O∶3血清型毒力菌株丟失質(zhì)粒的結(jié)果。同時其它基因型，很可能不致病或者致病能力弱。大量實驗證明，致病性耶爾森菌遺傳背景復雜，染色體DNA指紋分析具有多態(tài)性［8］，因此區(qū)分有無致病性，不僅需要PCR技術(shù)，而且還需要生化鑒定、血清凝集實驗等輔佐。值得關(guān)注的是，O∶8血清型在國外的分離株都是致病性菌株〔6〕，而我們分離到的菌株卻都是1A型，且缺乏毒力因子。

生豬咽拭子分離的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中83.99%（278/331）為致病性菌株，也進一步證實豬是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病菌株的最主要宿主。我國的養(yǎng)豬農(nóng)戶比例非常大，并且多是傳統(tǒng)的家庭式圈養(yǎng)，衛(wèi)生條件較差。豬－人傳播在我國確實存在很大的可能性，因此，作者認為，加強豬中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌產(chǎn)毒菌株攜帶率的監(jiān)測，將成為預防和控制本病的關(guān)鍵所在。

表3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因類型PCR檢測結(jié)果Tab.3 Virulence gene distribution of Yersinia enterocolitica isolates

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