微泡造影劑對高強度聚焦超聲殺傷離體棘球蚴的增強作用＊

蔡 輝，張 靜，2，葉 彬，2，趙毅峰，郭應興，韓秀敏，張成武

棘球蚴病（echinococcosis）是細粒棘球絳蟲的幼蟲棘球蚴寄生所致的一種嚴重的人獸共患病。在我國，該病主要流行于西北的農(nóng)牧區(qū)，嚴重影響著人畜健康并制約當?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展［1］。目前，傳統(tǒng)的包蟲病治療主要有手術(shù)和藥物治療兩種方式［2］，但各治療方法仍存在不少問題需要解決，科研人員正積極探索新的治療方法和手段。

高強度聚焦超聲（high intensity f ocused ultrasound，HIFU）作為一種新興的非侵入性治療技術(shù)，已經(jīng)用于實質(zhì)性腫瘤的臨床治療。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HIFU輻照棘球蚴對囊液內(nèi)的原頭蚴有肯定的殺傷效果，但一定功率的HIFU輻照并不能完全殺滅原 頭 蚴［3－4］。超 聲 造 影 劑 （ultrasound contrast agent，UCA）通過增加靶區(qū)組織內(nèi)空化核的數(shù)量，增強HIFU的消融作用［5－6］。本實驗就超聲造影劑能否增強高強度聚焦超聲對離體細粒棘球蚴的治療效率進行了探討。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器 JC型高強度聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)由重慶醫(yī)科大學超聲工程研究所研發(fā)、青海大學附屬醫(yī)院提供。該系統(tǒng)主要由可調(diào)功率發(fā)生器、治療頭、B超監(jiān)控系統(tǒng)（系統(tǒng)自帶灰度分析軟件）、機械運動控制系統(tǒng)和治療床等部分組成。治療頭工作參數(shù)如下：頻率1．0 MHz，功率0～400 W，連續(xù)可調(diào)，探頭直徑150 mm，焦距為110 mm。

1．1．2 主要試劑 超聲造影劑由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲影像學研究所提供（經(jīng)消毒處理，微泡直徑2．0～5．0μm）；0．25%臺盼藍溶液（臺盼藍為美國Gibco公司產(chǎn)品，以PBS溶液稀釋過濾，終濃度為0．25%）；滅菌注射用生理鹽水及其他試劑均為國產(chǎn)。

1．1．3 棘球蚴標本 感染棘球蚴的羊肝采自青海省西寧市某屠宰場。

1．2 方法

1．2．1 標本的選取和處理 感染細粒棘球蚴的羊肝取出后立即放入冰盒送往實驗場地。用生理鹽水洗凈羊肝表面血跡，B超檢測病灶大小，選取形狀為球形或近似球形，直徑20～50 mm，囊壁較薄，觸之柔軟的細粒棘球蚴作為實驗材料。將之修整成50 mm×50 mm×50 mm大小的正方體，浸于生理鹽水中，并在－0．05～－0．1 MPa的壓力下常規(guī)脫氣30 min。

1．2．2 實驗分組 根據(jù)包囊的直徑（近似球形包囊根據(jù)長軸，以下統(tǒng)稱直徑）分為6個不同的區(qū)組：I：20～25 mm直徑大小的包囊；Ⅱ：25～30 mm直徑大小的包囊；Ⅲ：30～35 mm直徑大小的包囊；Ⅳ：35～40 mm直徑大小的包囊；Ⅴ：40～45 mm直徑大小的包囊；Ⅵ：45～50 mm直徑大小的包囊。每組包囊25個。同一直徑區(qū)組的包囊每5個為一試驗組，隨機接受以下試驗：A組：普通B超照射的空白對照，B組：0．1 m L UCA 處理，C組：單純 HIFU輻照，D 組：0．1 m L UCA＋HIFU 輻照，E 組：0．2 m L UCA＋HIFU輻照。

1．2．3 超聲造影劑的處理及使用 用生理鹽水溶解超聲造影劑，震蕩搖勻。溶解后微泡濃度約為1×109個／m L，直徑3．5～4．5μm，分布均勻。用1 m L無菌注射器抽取含有混勻UCA的生理鹽水，經(jīng)肝組織穿刺入包囊內(nèi)，抽取少量囊液，混勻，反復抽吸3次，然后將液體全部注入包囊內(nèi)，最后緩慢退出注射器，盡量避免漏液。

1．2．4 HIFU輻照 治療靶區(qū)為超聲所顯示的病灶。實時監(jiān)測下對治療區(qū)域進行定位、掃描。治療掃描方式為點掃射，掃描速度3 mm／s，每個點掃描3次，每次3 s，層間距5 mm。治療功率為150 W。治療時間不等，由包囊大小決定。

1．2．5 治療前后灰度比較 包囊的每個層面治療結(jié)束后，肉眼觀察監(jiān)控圖像所示灰度變化，并立即用系統(tǒng)自帶灰度分析軟件分析靶區(qū)治療前后的灰度變化。

1．2．6 臺盼藍染色檢測原頭蚴死亡率 輻照后立即抽取囊液，混勻，取一滴囊液與0．25%的臺盼藍按照1∶1的比例涂片，每個包囊涂片3張，染色2 min，低倍鏡下每張玻片隨機計數(shù)200個原頭蚴，每個包囊共計數(shù)600個原頭蚴，統(tǒng)計其中活原頭蚴數(shù)目（活原頭蚴拒染呈透明狀，偶見收縮蠕動；死原頭蚴被染成藍色）。原頭蚴死亡率計算公式為：死亡率＝（1－活原頭蚴數(shù)／總原頭蚴數(shù)）×100%。

1．2．7 統(tǒng)計學方法 采用PASW 18．0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均用±s）表示。統(tǒng)計結(jié)果用隨機區(qū)組資料方差分析，檢驗標準P＜0．05。

2 結(jié) 果

2．1 超聲灰度改變 B超監(jiān)控觀察到單純UCA組灰度無變化（圖1B），單純HIFU輻照引起包囊邊緣回聲加強，內(nèi)部少量均勻增強（圖1C），UCA協(xié)同HIFU輻照能使包囊邊緣回聲加強和內(nèi)部團狀回聲增強，該增強比單純HIFU輻照明顯，并且變化程度隨加入UCA量的增加而增強（圖1D，1E）。

圖1 各種處理方式處理后B超監(jiān)控圖像Fig．1 The ultrasonic i mages of hydatid cysts after different treat ments of HIFUA：Control，the hydatid cyst presented clear margin and intranodular unifor m echogenicity；B：Treated with 0．1 m L UCA alone，there was no difference compared with group A；C：Treated with HIFU alone，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was ho mogeneously enhanced；D：Treated with 0．1 m L UCA＋HIFU，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was bolus－likely enhanced；E：Treated wit h 0．2 m L UCA＋HIFU，the echo of hydatid cyst enhanced in ri m－like style and the inside region was bolus－likelt enhanced．Further more，the enhancement was more obvious than that of group D （the treated areas were sho wn by green curves）．

用自帶的灰度分析軟件比較并記錄治療前后靶區(qū)的灰度改變值，數(shù)據(jù)（表1）表明單純UCA組的灰度增強無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），單純 HIFU輻照能引起灰度增強（P＜0．01），UCA協(xié)同HIFU輻照能使灰度增強更為明顯，且灰度增強值隨加入UCA量的增加而增大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。同時，加入同一劑量的UCA，如果包囊直徑相差很大，灰度增強值也存在差別，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），如果直徑相差不大，加入同樣劑量的UCA，灰度增強值無明顯差異（P＞0．05）。這就說明UCA協(xié)同HIFU輻照能增加靶區(qū)灰度增強，并且該增強的強度與UCA的劑量和包囊內(nèi)囊液的體積的比例存在一定的關(guān)系。

表1 各種處理方式處理后超聲灰度改變值Tab．1 Changes of ultrasonic gray scale of cysts after different treat ments of HIFU

2．2 棘球蚴囊液內(nèi)原頭蚴的死亡率 方差分析經(jīng)各種處理后棘球蚴囊液原頭蚴的死亡率（表2），除單純UCA組外（P＞0．05），其余處理組差別有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），即單純加入UCA并不能增加原頭蚴死亡率，HIFU輻照能增加原頭蚴死亡率，UCA協(xié)同HIFU照射能增加HIFU對原頭蚴的殺傷率，且殺傷率隨著UCA劑量的增加而加強。加入同樣劑量的UCA，如果包囊直徑相差很大，原頭蚴死亡率有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），如果直徑相差不大，加入同樣劑量的UCA，原頭蚴死亡率變化不大（P＞0．05）。這就說明UCA可提高 HIFU對離體細粒棘球蚴囊液內(nèi)原頭蚴的殺傷率，并且與UCA的劑量和包囊內(nèi)囊液的體積存在一定的關(guān)系。

表2 經(jīng)各種HIFU處理后棘球蚴囊液原頭蚴的死亡率（%）Tab．2 Instant death rate of protoscolices of hydatid after different treat ments of HIFU（%）

2．3 原頭蚴的形態(tài)觀察 染色后普通光學顯微鏡下觀察。對照組與單純UCA組：原頭蚴形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)部小鉤、鈣顆粒等結(jié)構(gòu)清晰可見，拒染呈透明狀（圖2 A，2B）。單純 HIFU組：部分原頭蚴死亡，臺盼藍著色，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，未見被膜破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)隱約可見（圖2C）。0．1 m L UCA＋HIFU輻照組：原頭蚴縮小變圓，深染色，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清（圖2D）。0．2 m L UCA＋HIFU輻照組：大部分原頭蚴死亡，被膜破壞，可見被膜碎片及大量小鉤、鈣顆粒（圖2E）。

圖2 各種處理對原頭蚴結(jié)構(gòu)的影響（臺盼藍染色，×100）Fig．2 The influence of different treat ments on structures of protoscolices（Tr ypan blue exclusion assay，×100）A：Control，alive protoscolices were not stained in blue and their str uct ures were clear；B：Treated with UCA alone，there was no any difference co mpared with group A；C：Treated with HIFU alone，some of protoscolices dead and dead ones were stained in blue and their structures were relatively clear；D：Treated with 0．1 m L UCA＋HIFU，dead protoscolices rounded to s maller sizes，and they were stained in blue deeply and their str uctures inside were indistinct；E：Treated with 0．2 mL UCA＋HIFU，protoscolices were broken into pieces，the numerous hooklets and calcareous bodies were scatted（shown as the arrow）．

3 討 論

HIFU利用超聲發(fā)射器分散發(fā)射高能超聲波，并在體內(nèi)將超聲波能量聚焦在選定的臟器組織區(qū)域，通過熱效應、空化效應和機械效應消除病灶而對焦點周圍組織沒有明顯影響［7］。實驗證明，HIFU輻照棘球蚴對囊液內(nèi)的原頭蚴有一定的殺傷效果，并且對囊壁的角皮層和生發(fā)層有破壞作用，從而使棘球蚴停止生長并逐漸退化［3－4］，但一定功率的 HIFU輻照并不能完全殺死原頭蚴，這可能是因為細粒棘球蚴與實質(zhì)性腫瘤明顯不同，其囊內(nèi)充滿囊液，HIFU照射聚焦囊內(nèi)不會產(chǎn)生瞬間高溫，達不到完全殺滅原頭蚴效果。若不能使超聲能量在囊液中大量沉積而使囊液中的原頭蚴、子囊、孫囊完全死亡，殘存的活原頭蚴等有引起棘球蚴病復發(fā)的可能。提高HIFU治療劑量（提高HIFU治療功率或延長治療時間）雖可全面徹底地覆蓋病灶，增加囊液內(nèi)原頭蚴的死亡率，但也會帶來一系列副作用，如增加對正常組織的損傷，延長治療時間，增加麻醉意外發(fā)生的機率等［5］。

理想的HIFU增效劑應具備以下特點：安全無毒副作用；給藥方便；在活體組織內(nèi)藥效持續(xù)穩(wěn)定，生物利用度高。超聲造影劑主要用于臨床診斷，沙衛(wèi)紅［5］、計曉娟［6］等的研究證明 UCA 能通過增強空化效應從而增加HIFU的治療效率，研究認為UCA微泡爆破改變了組織對入射聲波的反應，引起靶區(qū)能量聚集［8］，即超聲作用與“空化核”（微氣泡）在極短的時間內(nèi)產(chǎn)生微觀的劇烈反應，釋放出比原超聲輻照能量高出數(shù)倍的能量，從而增強HIFU殺傷效應。

本實驗觀察到單純HIFU照射能引起靶區(qū)灰度增強和增加原頭蚴的死亡率，這與王俊安、鄒曉毅［3－4］等人的研究結(jié)果一致，說明 HIFU 輻照對原頭蚴有一定的殺傷作用，即HIFU輻照對囊型包蟲病有一定的治療作用。單純加入UCA并不能引起靶區(qū)灰度改變和增加原頭蚴死亡率，但加入一定量的UCA協(xié)同HIFU照射能增加灰度增強和原頭蚴的死亡率，并且該變化與加入UCA劑量成正比。同時，若UCA劑量一定，該變化與包囊直徑呈反比。說明UCA能增強HIFU對細粒棘球蚴的殺傷效應，并且與囊液的體積和UCA劑量存在一定的關(guān)系。加入足量的UCA協(xié)同HIFU照射能破壞原頭蚴的結(jié)構(gòu)，能使部分原頭蚴的包膜碎裂，這與孔璟［P］等人的研究結(jié)果一致，分析原因，認為UCA通過增強HIFU輻射的空化效應，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，增加細胞膜的通透性，從而增加原頭蚴的死亡率，提高HIFU對細粒棘球蚴的治療效率。

本實驗在不增加HIFU治療劑量的前提下，利用UCA增強了HIFU對離體細粒棘球蚴的殺傷效應，為進一步研究HIFU殺傷實驗動物體內(nèi)細粒棘球蚴奠定了基礎(chǔ)。但是，如何在穿刺注入UCA時防止囊液的外漏從而預防繼發(fā)感染還是一個亟待解決的問題。另外，HIFU輻照最佳功率以及加入UCA的劑量與囊液體積的最佳比例也需要進一步探索，以便優(yōu)化治療參數(shù)，減少對病灶周圍正常組織的損傷，達到最佳治療效果。

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