纖維素酶輔助提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的工藝優(yōu)化研究

唐 俊 葛海濤 張云霞 杜 云

江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，江蘇鹽城224400

盾葉薯蕷又名黃姜、火頭根，為被子植物門，單子葉植物綱，薯蕷科，薯蕷屬多年生草本纏繞性植物，它是我國特有的甾體激素類藥源植物。其根莖含有薯蕷皂苷（俗稱皂素）、淀粉和纖維素，已被證實其中藥效成份薯蕷皂苷具有增強(qiáng)性功能、抗衰老、治療心血管疾病以及抑制癌細(xì)胞等功效，是合成各種避孕藥和載體激素類藥物的主要原料。薯蕷皂苷元提取工藝通常采用自然發(fā)酵酸水解法、分離法、酸水解法等，而這些方法的得率往往很低，且產(chǎn)生大量的酸水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

據(jù)宋發(fā)軍[1]報道盾葉薯蕷中含纖維素達(dá)50%以上，因此，本試驗擬采用纖維素酶法處理盾葉薯蕷中皂苷元，利用纖維素酶酶解可以破壞纖維素的β-D-葡萄糖苷聯(lián)結(jié)鍵，從而破壞其細(xì)胞壁，在水解時能夠最大限度地將薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化成薯蕷皂苷元，能夠顯著提高有效成分的提取收率。

響應(yīng)面分析法（response surface method,RSM）[2]是一種有效的優(yōu)化條件的方法，用于在加工過程中確定各因素及其交互作用對非獨(dú)立變量的影響，其表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系最為精確，同時也是最經(jīng)濟(jì)的方式，對所選的實驗參數(shù)可以較少的次數(shù)和較短的時間內(nèi)進(jìn)行全面研究，目前已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

本研究將主要考察纖維素酶輔助提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的提取方法，以薯蕷皂苷元收率為評價指標(biāo)，采用5因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到最優(yōu)提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

盾葉薯蕷藥材（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司提供）；薯蕷皂苷元對照品（中國藥品生物制品鑒定所提供）；纖維素酶（河南豐達(dá)生物科技有限公司，酶活力40 000 U/g）；甲醇（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，色譜純）；石油醚（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純）。

1.2 主要儀器

電子天平（AG135，METTLER TOLEDO公司）；循環(huán)水式真空泵（SHZ-DⅡ，鞏義市予華儀器廠），高效液相色譜（Waters 515 pump）；TGL-16B型臺式高速離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；2487紫外檢測器。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取工藝 稱取一定量盾葉薯蕷原料，加入一定比例的水以及纖維素酶，用醋酸鈉-醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至一定范圍，在40 ℃以上的水浴條件下攪拌提取一段時間后迅速升溫至90～100 ℃，保溫10 min，使酶滅活，紗布過濾得濾液，濾渣烘干后用石油醚回流提取8 h，熱過濾，合并濾液靜置至結(jié)晶完全，抽濾后濾餅烘干即得薯蕷皂苷元結(jié)晶。

工藝流程圖如下：

1.3.2 薯蕷皂苷元提取工藝的考察 用中心組合設(shè)計法（central composite design,CCD）進(jìn)行各影響因素的分析。數(shù)學(xué)模型：

考察因素（自變量）：

X1-盾葉薯蕷與水的料液比；X2-酶解pH值；X3-纖維素酶用量（U）；X4-酶解作用時間（h）；X5-酶解溫度（℃）

考察指標(biāo)（因變量）：

Y1-薯蕷皂苷元得率（%）

據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理，采用五因素三水平的響應(yīng)面分析方法。實驗因素水平見表1。

表1 實驗因素水平表

1.3.3 薯蕷皂苷元得率的測定方法 本研究采用反相高效液相色譜法測定薯蕷皂苷元含量。

色譜條件：色譜柱：島津VP-ODS（150 mm×4.6 mm×5μm）；流動相為甲醇：水=95∶5（V/V）；流速：1.0 mL/min；UV檢測波長為208 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫為25 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：取薯蕷皂苷元對照品0.250 0 g，用甲醇超聲溶解，并定容至100 mL，得2.50 g/L對照品溶液備用。

樣品溶液制備：稱取盾葉薯蕷20 g，按1.3.1提取方法進(jìn)行提取，所得的薯蕷皂苷元結(jié)晶加入甲醇超聲溶解，并定容至250 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，所得濾液按上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到薯蕷皂苷元含量。

薯蕷皂苷元得率為所得薯蕷皂苷元占盾葉薯蕷總量的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，并分別定容至 10 mL，濃度分別為 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g/L。分別經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液按上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，薯蕷皂苷元對照品溶液色譜峰如圖1所示。

圖1 薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

結(jié)果表明：薯蕷皂苷元在0.1～2.0 g/L之間具有良好的線性關(guān)系，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y= 0.015 8X + 0.017，相關(guān)系數(shù)為r=0.998 9。

2.2 提取工藝考察實驗結(jié)果及顯著性分析（表2）

表2 中心組合試驗設(shè)計結(jié)果

2.3 各因素對收率的影響分析

表3 對收率的方差分析表

方差分析結(jié)果表3顯示：酶解pH（X2）與纖維素酶（U）用量（X3）對盾葉薯蕷皂苷元收率（Y1）影響統(tǒng)計顯著（P值均小于0.005）。因此這兩個因素對響應(yīng)值起主導(dǎo)影響作用。筆者利用軟件Ststistic 6.0分析得到擬合全變量二次回歸方程，各變量的偏回歸系數(shù)估計值及方差分析結(jié)果，得到擬合方程為：

Y1=0.997 422-0.004 44X1+0.182 364X2+0.297698X3+0.046 667X4-0.04X5-0.346 119X12+0.184 844X2

2-0.453 166X3

2-0.073 881X42-0.113 881X5

2+0.031 250X1X2+0.021 250X1X3+0.008 750X1X4-0.001 250X1X5+ 0.043 909X2X3+0.031 250X2X4+0.011 250X2X5-0.008 750X3X4-0.008 750X3X5+0.023 750X4X5

響應(yīng)面是響應(yīng)值對各實驗因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上形象的看出最佳參數(shù)與各參數(shù)之間的相互作用。借助軟件Statistic根據(jù)回歸方程以酶解pH（X4）和纖維素酶用量X3為因素，其他因素全部選擇為水平2，繪出的擬合響應(yīng)面曲面如圖3。

由圖3響應(yīng)面可以看出隨著纖維素酶用量（X3）的增加，收率（Y1）顯著增加，在酶解pH值達(dá)到最大值的時候可得到收率的最值，而并不是在纖維素酶用量（X3）最大的時候。這是由于在一定條件下，酶濃度對酶的催化反應(yīng)速度產(chǎn)生影響，當(dāng)酶濃度較低時，酶活性中心被飽和，提取率隨著酶濃度的增加而迅速增加，而后酶濃度繼續(xù)增加時，反應(yīng)速度增加率就比較小，當(dāng)酶濃度增加至一定程度時，提取率達(dá)到一個限值，此時縱使再增加酶濃度時，反應(yīng)速度增加緩慢甚至減?。煌瑫r在不同pH值的條件下，可能會引起纖維素酶活的降低或升高，從本實驗結(jié)果來看，盾葉薯蕷提取薯蕷皂苷元的最適pH在5.0～6.0之間。

圖3 響應(yīng)面擬合Y1（X2，X4）

2.4 最優(yōu)水平確定及驗證試驗

考慮到實驗最終目的是要優(yōu)化得到纖維素酶輔助提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的提取方法，綜合各種因素的相互作用，根據(jù)二次多項回歸模型方程，利用利用軟件Ststistic 6.0中數(shù)學(xué)模型及快速登高法優(yōu)化出高提取率的工藝條件見表 4。

表4 最優(yōu)工藝條件參數(shù)

換算成實際工藝參數(shù)為：盾葉薯蕷與水的料液比為1∶10；酶解pH值為5.75；酶解溫度為54 ℃；酶解作用時間為2.5 h；纖維素酶用量10.8 U。根據(jù)所得到的提取工藝，筆者對盾葉薯蕷進(jìn)行重新提取，平行3次，所得薯蕷皂苷元的收率平均為1.53%，遠(yuǎn)優(yōu)于之前盾葉薯蕷的傳統(tǒng)提取工藝方法。

3 結(jié)論

在纖維素酶酶解法提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的試驗過程中，筆者利用中心組合設(shè)計實驗法及Ststistic 6.0軟件響應(yīng)面分析法分析功能優(yōu)化得到了明顯提高薯蕷皂苷提取率的提取工藝條件，結(jié)果證明了本實驗設(shè)計統(tǒng)計方法能快速有效的實現(xiàn)工藝條件優(yōu)化，其優(yōu)化后的條件效果較為理想，在薯蕷皂苷元生產(chǎn)研究領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景以及指導(dǎo)意義。

[1]宋發(fā)軍.甾體藥源植物薯蕷屬植物中薯蕷皂苷元的研究及生產(chǎn)狀況[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，14（3）：89-92.

[2]惠尉，張東旭.響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽酸丁螺環(huán)酮微球制備工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥 2008，19（9）：2268-2271.

[3]Muralidhar RV，Chirumamila RR.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon soures[J].Biochemical Engineering Journal，2001，9（1）：17.