單個(gè)核細(xì)胞源性血管內(nèi)皮生長因子在急性心肌梗死患者中的動(dòng)態(tài)變化及意義

洪蒼浩 湯國法 劉曉紅

武鋼集團(tuán)鄂鋼醫(yī)院心內(nèi)科，湖北鄂州 463002

血管內(nèi)皮生長因子在缺血性心臟病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，動(dòng)脈粥樣硬化的形成，冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后再狹窄都與生長因子參與的細(xì)胞增殖、遷移、分化與凋亡有密切關(guān)系。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）強(qiáng)有力的有絲分裂原，在缺血、缺氧及血管損傷時(shí)能促進(jìn)VEC增殖、遷移及誘導(dǎo)血管生成，是迄今所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的一種血管內(nèi)皮生長因子。由于冠心病是以心肌缺血為主要特征，外源性VEGF已成為目前促血管生成、重建冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)的研究熱點(diǎn)。目前，在應(yīng)用外源性VEGF基因轉(zhuǎn)染治療心肌缺血方面研究很多，而對(duì)不同來源的內(nèi)源性VEGF在心肌缺血時(shí)所起的作用研究甚少。本研究通過觀察AMI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌的VEGF水平的動(dòng)態(tài)變化來探討不同來源的內(nèi)源性VEGF在AMI患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者為2010年1月～2011年6月筆者所在醫(yī)院心血管內(nèi)科住院確診的急性心肌梗死患者28例，其中男20例，女8例，平均年齡（58.7±7.9）歲。12例正常體檢者作對(duì)照，其中男9例，女3例，平均年齡（55.6±6.3）歲。28例AMI患者均進(jìn)行了冠脈造影（coronary angiography，CAG），并實(shí)施經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張和支架植入術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent，PTCA+stent），所有患者均常規(guī)服用阿司匹林和氯吡格雷，并根據(jù)醫(yī)生建議服用β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等藥。28例患者CAG檢查結(jié)果：單支血管病變11例，2支血管病變9例，3支血管病變8例。合并高血壓病的有15例（54%），高脂血癥23例（82%），糖尿病7例（25%），18例患者有吸煙史（64%），8例有冠心病家族史（28%）。

1.2 急性心肌梗死的診斷

根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)持續(xù)典型的胸痛30 min以上；典型心電圖動(dòng)態(tài)變化；心肌酶（肌酸磷酸激酶及其同工酶MB或肌鈣蛋白）動(dòng)態(tài)變化。具有以上中任何2項(xiàng)即可確診。

1.3 正常對(duì)照者入選條件

對(duì)照組與AMI組進(jìn)行性別、年齡配對(duì)，經(jīng)病史詢問無心血管疾病史，體格檢查無陽性體征，胸片、心電圖、肝腎功能、生化常規(guī)檢查無異常者。合并嚴(yán)重心衰、肝、腎功能衰竭、感染性疾病、腫瘤、外周血管病、腦卒中者予以剔除。

所有患者在發(fā)病2 d內(nèi)進(jìn)行床旁心臟彩色多普勒超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），半月后（出院時(shí)）復(fù)查LVEF（由心臟彩超室專人質(zhì)控檢測）。

1.4 主要儀器和試劑

CO2培養(yǎng)箱：美國Formal Scientific公司；Lympus倒置顯微鏡：日本；酶聯(lián)免疫檢測儀：美國EL312eVEGF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒：北京晶美生物工程有限公司（進(jìn)口分裝），檢測靈敏度為30 pg/mL，批內(nèi)、批間誤差均＜9.5%；淋巴細(xì)胞分離液：Ficoll-Hypaque液，中科院血液研究所；PBS液：新鮮配制；RPMI-1640：GIBCO，美國；小牛血清：筆者所在醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制備；雙抗：青霉素100 IU/mL，鏈霉素100μg/mL。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離和培養(yǎng)及標(biāo)本的提取

1.5.1.1 PBMCs的分離 （1）在AMI患者發(fā)病的第1、5、10、15天分別抽取20 mL靜脈血放入肝素抗凝離心管內(nèi)，搖勻，用PBS液稀釋血液1倍，對(duì)照組僅抽1次靜脈血。（2）取淋巴分離液4 mL，放入15 mL離心管中。（3）將稀釋全血沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于淋巴分離液上，稀釋血液與分離液體積之比約為2∶1。（4）用水平離心機(jī)以2 000 rpm離心20 min，離心后，單個(gè)核細(xì)胞位于血漿和淋巴分離液界面層。（5）吸取界面單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗滌3次，每次1 500 rpm離心10 min，吸棄上清，加入1 mL RPMI 1640，混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用苔盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，均＞95%。

1.5.1.2 PBMCs的培養(yǎng) （1）用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸單個(gè)核細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×106/mL。（2）取1 mL濃度為5×106/mL PBMCs懸液放入24孔培養(yǎng)板中，在37℃，5%CO2條件下于培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5.1.3 標(biāo)本的提取 分別于6、12、24 h收取PBMCs培養(yǎng)的上清液，置-70℃冰箱保存待測。

1.5.2 血清肌酸磷酸激酶（CK）最大值的測定 AMI患者發(fā)病后每4 小時(shí)測1次CK直到最大值（由檢驗(yàn)科專人質(zhì)控檢驗(yàn)）。

1.5.3 VEGF的測定 外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)分泌的VEGF量均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定，濃度單位為pg/mL。按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)于偏態(tài)分布的計(jì)量資料，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換達(dá)到近似正態(tài)分布后，再進(jìn)行比較。各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均以（± s）表示。采用直線相關(guān)分析法分析相關(guān)指標(biāo)間相關(guān)性，計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMCs產(chǎn)生的VEGF水平的動(dòng)態(tài)變化

PBMCs培養(yǎng)產(chǎn)生的VEGF水平在不同培養(yǎng)時(shí)間段呈動(dòng)態(tài)變化，用“PBMC-VEGF”表示PBMCs培養(yǎng)產(chǎn)生的VEGF水平。為了便于觀察，首先對(duì)AMI發(fā)病第1天分離的PBMCs培養(yǎng)產(chǎn)生的VEGF進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。見表1。從表中可見PBMCVEGF水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加，在12 h和24 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。取培養(yǎng)24 h的PBMCs產(chǎn)生的VEGF量作為觀察PBMCs分泌VEGF能力的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。AMI患者從發(fā)病第1～15天，PBMC-VEGF水平呈動(dòng)態(tài)變化。見表2。從表中可見，AMI組PBMC-VEGF水平從發(fā)病第1天開始升高，在第5天達(dá)峰值為（343.2±82.5）pg/mL，顯著高于對(duì)照組的（143.3±24.2）pg/mL（P＜0.05）。隨后呈下降趨勢，但仍顯著高于對(duì)照組，到發(fā)病第15天PBMC-VEGF水平仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 AMI患者第1天PBMC-VEGF水平的變化（± s，pg/mL）

表1 AMI患者第1天PBMC-VEGF水平的變化（± s，pg/mL）

注：與對(duì)照組同時(shí)間比較，*P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 24 h對(duì)照組 12 78.5±22.1 95.3±27.0 143.3±24.2 AMI組 28 104.3±22.5 159.2±31.6* 206.0±43.7*

表2 AMI患者PBMC-VEGF水平的變化（n，pg/mL）

2.2 VEGF與心肌酶CK的相關(guān)性

AMI患者心肌酶峰值CK為929.8～3 827.2 IU/L，平均（2 185.9±320.3）IU/L。為了探討VEGF水平與急性心肌梗死時(shí)心肌酶升高的關(guān)系，對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC-VEGF水平與CK峰值進(jìn)行線性相關(guān)分析，PBMC-VEGF峰值與CK無顯著相關(guān)性。

2.3 VEGF水平與左室收縮功能的關(guān)系

為了探討VEGF水平與左室收縮功能（LVEF）的關(guān)系，將入院時(shí)LVEF水平（52.3±2.6）%與半月后（出院時(shí)）復(fù)查的LVEF水平（52.7±2.8）%進(jìn)行比較，結(jié)果兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將LVEF水平分成兩組，A組為AMI患者半月后復(fù)查時(shí)LVEF水平不低于入院時(shí)LVEF水平，有12例，B組為AMI患者半月后復(fù)查時(shí)LVEF水平低于入院時(shí)LVEF水平，有16例，然后分別比較A、B兩組PBMC-VEGF水平之間的關(guān)系。見表3。

表3 AMI患者VEGF水平與左室收縮功能的關(guān)系（± s）

表3 AMI患者VEGF水平與左室收縮功能的關(guān)系（± s）

注：與B組比較，*P＜0.05

組別 n LVEF（%） PBMC-VEGF（pg/mL）A組 12 55.6±2.7* 867.6±113.1*B組 16 50.8±2.1 34.8±82.4

3 討論

VEGF是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的眾多血管生長因子中最有力的血管生成因子，VEGF通過與細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合而發(fā)揮作用，目前發(fā)現(xiàn)有3種特異受體分別為flt-1、flk-1/KDR和flt-4，屬酪氨酸激酶受體家族第三亞型[1]，其中flt-1和flt-1/KDR主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在人的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均有高水平表達(dá)，提示VEGF在心血管系統(tǒng)的功能主要以旁分泌和自分泌的形式實(shí)現(xiàn)[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，從AMI患者外周靜脈血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞能分泌VEGF，PBMCs分泌的VEGF在AMI后即呈上升趨勢，于心梗后第5天上升到最高峰，隨后10 d內(nèi)仍維持高值狀態(tài)，且顯著高于對(duì)照組，但PBMCs分泌VEGF的高峰值與心肌酶CK高峰值無顯著相關(guān)性。從以上結(jié)果可見，AMI后，由PBMCs產(chǎn)生的VEGF水平迅速上升，目前，鮮有此類報(bào)道，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，可能與AMI發(fā)生后，產(chǎn)生VEGF的PBMCs的種類發(fā)生改變和（或）其分泌VEGF的功能得以加強(qiáng)有關(guān)，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Zhao等[3]發(fā)現(xiàn)，心肌梗死處VEGF mRNA基因表達(dá)在AMI后2 h就迅速增高，12 h達(dá)高峰。引起VEGF表達(dá)增加的原因是多方面的。以上結(jié)果顯示，心肌缺血、缺氧可能是刺激心肌細(xì)胞VEGF迅速高表達(dá)并在特定時(shí)間內(nèi)持續(xù)的主要始動(dòng)因素，AMI后分泌的生物活性物質(zhì)可能是AMI亞急性期VEGF持續(xù)高表達(dá)，并維持一定時(shí)間的原因之一[4]。

在研究VEGF水平與AMI患者左室收縮功能關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，左室收縮功能有改善的AMI患者，其PBMC-VEGF水平顯著高于左室收縮功能下降的AMI患者。推測AMI患者左室收縮功能的改善可能與PBMCs產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF在參與修復(fù)損傷血管內(nèi)皮和促進(jìn)血管生成方面有密切關(guān)系。VEGF是迄今所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的一種血管內(nèi)皮生長因子，能特異地作用于靶細(xì)胞－VEC，促進(jìn)其有絲分裂及血管形成。Zhao等[3]發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)有VEGF mRNA的表達(dá)，同時(shí)伴有血管密度高水平表達(dá)可持續(xù)7 d以上，提示VEGF可能參與心肌梗死的血管重建。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)重組VEGF基因能改善AMI患者的左室收縮功能，局部梗死區(qū)心肌室壁異常運(yùn)動(dòng)也明顯改善。以上結(jié)果顯示，通過有效方法使特定部位的內(nèi)源性VEGF基因和蛋白表達(dá)升高到一定程度，就能充分發(fā)揮其促血管生成，增加缺血心肌灌注，改善AMI患者左室收縮功能。

單個(gè)核細(xì)胞不但能分泌VEGF，且能介導(dǎo)VEGF對(duì)炎性細(xì)胞的趨化反應(yīng)，與炎性細(xì)胞在血管生成中的作用有關(guān)[6]。Ripa等[7]發(fā)現(xiàn)，冠心病患者建立側(cè)支循環(huán)以改善進(jìn)行性冠脈狹窄的能力與單核細(xì)胞缺氧時(shí)產(chǎn)生的VEGF mRNA的能力有關(guān)，建立側(cè)支循環(huán)的患者與沒有建立側(cè)支循環(huán)的患者相比，單核細(xì)胞缺氧時(shí)VEGF mRNA表達(dá)水平有顯著差異。以上結(jié)果提示，急性心肌梗死時(shí)，單個(gè)核細(xì)胞趨化、粘附在損傷的血管內(nèi)皮部位，促使內(nèi)源性VEGFm RNA高表達(dá)及VEGF蛋白大量生成，發(fā)揮VEGF促內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、修復(fù)血管內(nèi)皮和促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立等作用，增加缺血區(qū)血流灌注，抑制缺血、梗死范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大，達(dá)到改善心臟收縮功能的作用。推測在AMI發(fā)生時(shí)，通過促進(jìn)粘附在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷處PBMCs產(chǎn)生的VEG FmRNA高表達(dá)，可達(dá)到改善AMI患者心功能目的，詳細(xì)的機(jī)制有待更深入的研究。

在AMI患者急性期，由PBMCs產(chǎn)生的VEGF在改善左室收縮功能方面可能起重要作用。

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