酵母雙雜交篩選PMEPA1互作蛋白

羅深恒，許麗紅，楚 雯，馬 岳，刁愛(ài)坡

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protein，androgen induced 1)N-端含有1個(gè)跨膜區(qū)，由252個(gè)氨基酸組成，在正常的前列腺組織大量表達(dá)，在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)量低，且表達(dá)水平受雄激素的調(diào)控［1-2］，如經(jīng)雄激素抑制劑處理雄激素依賴(lài)的前列腺癌細(xì)胞LNCaP，PMEPA1表達(dá)明顯下降［3］．說(shuō)明PMEPAl是一個(gè)雄激素誘導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，通過(guò)DNA甲基化介導(dǎo)的表達(dá)沉默在前列腺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［4］．

Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)屬于泛素連接酶家族的一員［5］，Nedd4泛素化與PMEPA1互作，其功能還不清楚［2，6］．

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)從人cDNA文庫(kù)中篩選PMEPA1的互作蛋白，進(jìn)一步研究PMEPA1蛋白質(zhì)間互作在前列腺癌細(xì)胞癌變中的作用，為探索治療前列腺癌的新方法提供科學(xué)理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料

大腸桿菌Top10和BL21-RIPL感受態(tài)細(xì)胞，純化重組蛋白 His-PMEPA1、GST-Nedd4、GSTGolgin84，PMEPA1兔多克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存;酵母雙雜交系統(tǒng)試劑盒(含表達(dá)載體pGBKT7質(zhì)粒，pGADT7質(zhì)粒)和酵母菌株Y187(含人cDNA文庫(kù))，Y2H Gold均購(gòu)自Clontech公司;內(nèi)切酶NdeⅠ、Eco RⅠ及T4DNA連接酶，PCR高保真酶pfu、Taq酶購(gòu)自Fermentas公司;DNA純化和小提質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Clontech公司;谷胱甘肽瓊脂糖凝膠層析柱購(gòu)自 GE healthcare公司;YPD、-Trp Do Supplement、-Leu-Trp Do Supplement、-Leu-Trp-His-Ade Do Supplement、X- α -Gal、Aureobasidin A 為Clontech公司產(chǎn)品．

1．2 方法

1．2．1 誘餌蛋白載體的構(gòu)建 以人PMEPA1基因?yàn)槟０?，上游引?5’-CACTACAAGCTG TGTCTG-3’，下游引物 5’--3’．PCR 擴(kuò)增PMEPA1序列，下劃線酶切位點(diǎn)分別為NdeⅠ和Eco RⅠ．PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸90 s，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存．產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的DNA片段后利用NdeⅠ和Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切，隨后與經(jīng)酶切好的pGBKT7載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定后，由北京華大基因公司測(cè)序鑒定．

1．2．2 免疫印跡檢測(cè)誘餌蛋白的表達(dá) 參照Clontech說(shuō)明的乙酸鋰法將誘餌載體pGBKT7-PME-PA1和空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold，涂布SD/-Trp固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d后，挑取轉(zhuǎn)化子在50mL SD/-Trp培養(yǎng)液中培養(yǎng)20～24 h．裂解菌體并提取酵母菌蛋白，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后直接經(jīng)半干法將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用一抗PMEPA1兔多克隆抗體和二抗Alexa680標(biāo)記羊抗兔IgG(Invitrogen)免疫印跡檢測(cè)PMEPA1在酵母菌中的表達(dá)．

1．2．3 誘餌蛋白的毒性和自激活檢測(cè) 將構(gòu)建好的pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7空載體分別轉(zhuǎn)化到酵母 Y2H Gold中，同時(shí)在 SD/-Trp和 SD/-Trp/X-α-Gal/-Aba固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后觀察，比較菌落生長(zhǎng)情況，確定蛋白是否有自激活作用和菌體毒性．

1．2．4 誘餌質(zhì)粒與文庫(kù)的雜交篩選 轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PMEPA1到酵母Y2H Gold中，在SD/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0．8，離心，收集菌體，用5 mL新鮮SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸，加入1 mL含有文庫(kù)質(zhì)粒的酵母菌Y187，加入45 mL 2×YPDA培養(yǎng)基在30℃，30～50 r/min，培養(yǎng)20～24 h．離心，菌體用5 mL 0．5×YPDA重懸后，按200μL/板均勻涂布于直徑150 mm的SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/-Aba(DDO/X/A)的平板上(約30塊)，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d．轉(zhuǎn)移≥2 mm的陽(yáng)性克隆到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d，然后根據(jù)酵母在不同缺陷型培養(yǎng)基上的表型分析結(jié)果并鑒定陽(yáng)性克?。崛∧芡瑫r(shí)激活4個(gè)報(bào)告基因的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，經(jīng)氨芐霉素抗性篩選，提取獵物質(zhì)粒．

1．2．5 陽(yáng)性克隆的復(fù)轉(zhuǎn)驗(yàn)證和序列分析 將候選的質(zhì)粒與pGBKT7-PMEPA1重新共轉(zhuǎn)至酵母Y2H Gold中，經(jīng)DDO/X/A和QDO/X/A等2輪篩選后確定復(fù)轉(zhuǎn)陽(yáng)性的質(zhì)粒，并送公司測(cè)序，序列結(jié)果用Research和NCBI上BLAST等工具進(jìn)行分析．

1．2．6 GST Pull-down實(shí)驗(yàn) 以 pGADT7-dynactin6為模板，上游引物:5’GAGAAGACTCAAAA GAGTG-3’，下游引物:5’-

TTAGTTCTTTACTGGAGTTG-3’，PCR擴(kuò)增Dynactin6基因，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，與載體pGEX-4T-2連接構(gòu)建pGEX-4T-2-Dynactin6重組質(zhì)粒．轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-RIPL感受態(tài)細(xì)胞，使用終濃度為1mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)過(guò)夜，細(xì)菌收集后使用裂解液重懸，超聲破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，收集上清，上清與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠層析柱4℃孵育2 h，經(jīng)PBS洗滌3次，用20 mmol/L的還原性谷胱甘肽洗脫，再經(jīng)PD10柱除鹽．

以Nedd4+PMEPA1為陽(yáng)性對(duì)照，Golgin84+PMEPA1為陰性對(duì)照．取5μg純化蛋白GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GST-Golgin84 分別與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠層析柱4℃孵育2 h，裂解液洗滌3次，離心棄上清，各加入0．5μg的His-PMEPA1于4℃孵育2 h，裂解液洗滌3次，離心棄上清，加入40 μL SDS上樣緩沖液，western印跡檢測(cè)．

2 結(jié)果與分析

2．1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PM EPA1的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)Genebank中編號(hào)為199169．1的PMEPA1基因序列，利用PCR擴(kuò)增不含跨膜區(qū)的PMEPA1序列，獲得約690 bp的目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用NdeⅠ和Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切后連接到pGBKT7載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，PCR和酶切驗(yàn)證(圖1)，目的片段和質(zhì)粒大小正確．測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒讀碼框架正確，可用于酵母雙雜交篩選．

圖1 重組質(zhì)粒的PCR(A)和酶切驗(yàn)證(B)Figure 1 Identification by PCR(A)and enzyme digestion(B)of recombinant plasmid

2．2 誘餌蛋白的表達(dá)

將pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取酵母菌蛋白，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入誘餌載體pGBKT7-PMEPA1的酵母菌中有外源蛋白PMEPA1表達(dá)，而轉(zhuǎn)入空載體pGBKT7的酵母菌中未檢測(cè)到PMEPA1表達(dá)(圖2)，表明人PMEPA1蛋白成功在酵母菌Y2H Gold中表達(dá)，可以利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人cDNA文庫(kù)中篩選潛在的互作蛋白．

2．3 誘餌蛋白的毒性和自激活檢測(cè)

將pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold后，涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-gal/-Aba缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d．轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-PMEPA1和空載體pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp上均能正常生長(zhǎng)(圖3)，表明蛋白沒(méi)有菌體毒性;轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-PMEPA1和空載體pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/-Aba上均不能生長(zhǎng)，結(jié)果與預(yù)期一致，表明誘餌蛋白不具有自激活的活性．

圖2 誘餌蛋白的表達(dá)檢測(cè)Figure 2 Expression assays of bait protein

圖3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PMEPA1的毒性和自激活檢測(cè)Figure 3 Toxicity and auto-activation assays of bait plasmid

2．4 人cDNA文庫(kù)的篩選和陽(yáng)性克隆的鑒定

將含有人cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的酵母菌Y187和含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PMEPA1的酵母菌Y2H Gold，在SD/Trp-/-Leu/X-α -gal/-Aba(DDO/X/A)缺陷培養(yǎng)基(150 mm)上共培養(yǎng)3～5 d，得到138個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行His、Ade的表型分析，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到 SD/Trp-/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)缺陷培養(yǎng)基(100 mm)上培養(yǎng)3～5 d，結(jié)果獲得78個(gè)陽(yáng)性克?。崛≠|(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)氨芐霉素抗性篩選獲得獵物質(zhì)粒，隨后與pGBKT7-PMEPA1共轉(zhuǎn)酵母Y2H Gold，經(jīng)DDO/X/A和QDO/X/A等2輪復(fù)轉(zhuǎn)驗(yàn)證后，得到17個(gè)陽(yáng)性的質(zhì)粒(圖4)．測(cè)序后獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆，表明均為編碼動(dòng)力蛋白激活蛋白Dynactin6基因．

2．5 GST pull-down驗(yàn)證PMEPA1與Dynactin6相互作用

純化蛋白 GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GSTGolgin84分別與與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠層析柱結(jié)合后，與His-PMEPA1蛋白共孵育后，結(jié)合物經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，用PMEPA1抗體進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)．Nedd4+PMEPA1泳道為陽(yáng)性對(duì)照，Golgin84+PMEPA1泳道為陰性對(duì)照(圖5)，Dynactin6+PMEPA1泳道檢測(cè)到PMEPA1，表明Dynactin6與PMEPA1蛋白存在相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母雙雜交的篩選結(jié)果．

圖4 缺陷培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性質(zhì)粒Figure 4 Screening of positive plasmids on dropoutmedia

圖5 GST pull-down驗(yàn)證PMEPA1與Dynactin6相互作用Figure 5 Identification of interaction by GST pull-down

3 討論

研究蛋白相互作用的方法很多，其中酵母雙雜交技術(shù)一直被認(rèn)為是最為靈敏和可信的方法之一．本研究利用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)，酵母菌Y2H Gold具有4個(gè)報(bào)告基因(ADE2，HIS3，MEL1，AUR1-C)，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)發(fā)生相互作用形成完整GAL4結(jié)構(gòu)時(shí)被激活表達(dá)，作者以PMEPA1-GAL4 DNA結(jié)合域融合蛋白為誘餌，篩選用GAL4轉(zhuǎn)錄激活域構(gòu)建的人cDNA文庫(kù)．通過(guò)對(duì)人cDNA文庫(kù)進(jìn)行選擇性平板篩選，及測(cè)序和序列分析，確定了3個(gè)陽(yáng)性克隆，均為編碼動(dòng)力蛋白激活蛋白Dynactin6基因，GST pull-down實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證PMEPA1與Dynactin6蛋白間的相互作用(圖5)．

Nedd4基因片段較大(為2．7 kb)，并且其3’非編碼區(qū)有3 kb，導(dǎo)致篩選用的cDNA文庫(kù)中沒(méi)有含Nedd4基因片段．

PMEPA1是一個(gè)前列腺跨膜蛋白，在前列腺中大量表達(dá)，而PMEPA1蛋白在前列腺細(xì)胞癌變過(guò)程中表達(dá)水平明顯下降或者缺失［6］．Nedd4能夠通過(guò)泛素依賴(lài)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解，對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過(guò)程起著重要的作用．

動(dòng)力蛋白激活蛋白Dynactin復(fù)合體是真核細(xì)胞中由多亞基組成的蛋白復(fù)合物，與動(dòng)力蛋白dynein結(jié)合，使其沿微管做長(zhǎng)距離囊泡運(yùn)輸，并且在細(xì)胞有絲分裂及分化成熟中發(fā)揮重要作用［7］．組成Dynactin復(fù)合體的亞基按其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為3類(lèi):(1)長(zhǎng)臂樣結(jié)構(gòu)亞基蛋白:DCTN1，DCTN 2和DCTN3;(2)Arp1棒狀結(jié)構(gòu)亞基蛋白:Arp1，actin，CapZ;(3)尖末端亞基蛋白:Arp11，DCTN4，DCTN5，DCTN6［8］．DCTN 1直接與動(dòng)力蛋白和微管結(jié)合，對(duì)Dynactin復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能維護(hù)發(fā)揮至關(guān)重要的作用;DCTN2影響微管到中心體的錨固［9］;DCTN4直接結(jié)合Arp1亞基［10］．Arp1亞基已經(jīng)被證明是 Dynactin復(fù)合體和囊泡結(jié)構(gòu)(如高爾基體)連接的結(jié)構(gòu)域［11］．

動(dòng)力蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜細(xì)胞器運(yùn)輸中有重要功能［12］．PMEPA1 是高爾基體相關(guān)的跨膜蛋白［6］，在胞內(nèi)體上也有定位［13］，本研究結(jié)果暗示動(dòng)力蛋白激活蛋白Dynactin6可能參與調(diào)控PMEPA1在高爾基體和胞內(nèi)體間的運(yùn)輸．

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