微波輻照對牙周膜細胞中白細胞介素6 的影響

陳曄 謝文泵 莊文捷

白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是一種細胞因子，它的來源很廣泛，其生物學活性多樣，在機體的炎癥反應及免疫應答中發(fā)揮著至關重要的作用[1-2]。許多研究表明，白細胞介素-6的表達在病變的牙周組織中廣泛的存在，并且明顯高于在正常牙周組織中的表達[2-3]。IL-6的表達水平已經(jīng)成為牙周組織破壞程度的指標，誘導牙周組織血管內(nèi)皮生長因子表達，炎癥細胞增多及能量消耗，從而加重炎癥反應。牙周炎癥時患牙齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）中IL-6的水平比正常牙中高出許多，并且牙周組織的破壞和牙周疾病的嚴重程度與IL-6的水平成正比關系[3-4]。本研究的目的是比較在微波治療后人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）IL-6的水平的變化，為臨床使用微波來治療牙周疾病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要器材和試劑

青-鏈霉素混合液（Hyclone，美國），DMEM低糖培養(yǎng)基（GIBCO,美國），胎牛血清（GIBCO，美國） 胰蛋白酶（GIBCO，美國），MTS（Promega， 美國），二甲基亞砜（Sigma,美國），酶聯(lián)免疫檢測儀（Biotek POWERWAVE，美國），微波治療儀（新技術研究所，南京），人白細胞介素6 ELISA 試劑盒（欣博盛，深圳）。

1.2 標本取材及原代培養(yǎng)

收集2018年7月醫(yī)院口腔科門診12～17歲因正畸治療而拔除的健康前磨牙10顆（共5位患者，征求患者及家長同意），要求患者術前用3%H2O2漱口，然后口內(nèi)及口周分別使用75%的酒精消毒，拔牙中注意避免損傷牙齒的牙周組織，拔牙后馬上把前磨牙放入含雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS液）中，在超凈臺內(nèi)，牙根面的血污使用含雙抗的PBS液反復沖洗去除干凈，再將根中1/3牙周膜組織用手術刀片輕刮取，用眼科剪將牙周組織剪成1 mm3大小，放置于合成細胞培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液中浸泡。使用6孔板，滴入含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、200 mL/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在每孔內(nèi)，在6孔板中的培養(yǎng)液中放入剪好的牙周組織塊，每孔放入5～6塊。組織塊上慢慢蓋上滅菌的蓋玻片，然后輕輕加壓，使蓋玻片與組織塊之間充盈著培養(yǎng)液，不能有氣泡產(chǎn)生，加體積分數(shù)為10%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液3 mL，放入100%濕度，5% CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液一次。第2天在鏡下觀察有無細菌污染組織塊，取細胞培養(yǎng)板時要求輕拿輕放，盡量避免晃動培養(yǎng)板，3天后每天在倒置顯微鏡下觀察細胞游出情況，生長狀況和形態(tài)特征。當看到組織塊周圍有細胞密集生長時，可以進行原孔消化。倒掉原培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕漂洗培養(yǎng)板兩遍，用無菌鑷子夾出蓋玻片，滴加2.5 g/L的胰蛋白酶，至鋪滿培養(yǎng)板底。鏡下觀察，當細胞質(zhì)回縮變圓，細胞間隙變大時，停止滴加胰酶，再加體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL。輕輕吹打培養(yǎng)板，使孔板內(nèi)細胞均勻分布，換培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)[5-6]。

1.3 細胞傳代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)需等到原孔消化，孔板底部表面積80%～90%有細胞生長。

1.4 微波照射分組及方法

當對數(shù)期生長到第4代hPDLCs單細胞懸液時，取出10 μL與等體積0.4%臺盼藍混勻，用細胞計數(shù)板來計數(shù)細胞活力。根據(jù)計數(shù)結(jié)果來制備2.0×104/mL的細胞懸液（含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液）。為了減少組間差距。每種6個孔，細胞懸液重新混勻后再接種，并且按照“s”型接種。將hPDLCs單細胞懸液隨機分組，共分對照組共24孔（僅含胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基）：只加培養(yǎng)液而沒有細胞，不接受微波照射。高劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照40 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養(yǎng)基進行誘導并接受40 s微波照射。中劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照20 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養(yǎng)基進行誘導并接受20 s微波照射。低劑量組共24孔（10 μg/mL LPS＋微波輻照10 s）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養(yǎng)基誘導并接受10 s微波照射。模型組共24孔（10 μg/mL LPS）：細胞懸液加入含10 μg/mL的LPS的培養(yǎng)基進行誘導不接受微波照射。每孔接種100 μL。調(diào)整治療儀的輸出模式為治療模式，調(diào)節(jié)為14 W的輸出功率，輻照后進行細胞培養(yǎng)24 h、48 h后提取培養(yǎng)上清液。

1.5 ELISA法檢測IL-6的表達

把上述細胞組條件培養(yǎng)液在常溫下溶解。按ELISA試劑說明書，分別在包被了人IL-6單抗的ELISA 120孔板中加入100 μL細胞條件培養(yǎng)液，使用雙抗體夾心法檢測。待終止反應后，用酶聯(lián)免疫檢測儀Bio-tek檢測450 nm的光密度值（D450）。根據(jù)ELISA試劑盒中的IL-6標準品D450值曲線，換算出所測定細胞條件培養(yǎng)液中IL-6的水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以表示，采用t 檢驗和單因素方差分析，兩組間差異的顯著性檢驗用 LSD 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

低功率微波對人牙周膜細胞分泌IL-6的影響如表1所示：10 μg/mL LPS刺激hPDLCs的模型組24 h、48 h[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]后IL-6表達均高于對照組[（0.515±0.091）pg/mL，（0.560±0.126）pg/mL]、高劑量組[（0.582±0.090）pg/mL，（0.620±0.117）pg/mL]、中劑量組[（0.760±0.147）pg/mL，（0.730±0.161）pg/mL]，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但與低劑量組[（0.835±0.132）pg/mL，（0.845±0.092）pg/mL]比較，輻照時間為10 s時，24 h、48 h后IL-6的表達量與相應模型組[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而輻照時間為20 s、40 s時，IL-6表達量均較模型組低（P＜0.05），且隨著輻照時間延長，IL-6的表達明顯受到抑制，且呈劑量依賴性。

3 討論

微波熱療是將微波能量集中照射病變部位，被人體組織吸收后，產(chǎn)生微波熱效應[7]、生物效應等。通過血流速度和血循環(huán)量增加促進血液循環(huán)來促進炎癥吸收，改善對細胞的營養(yǎng)供給、局部代謝及營養(yǎng)狀態(tài)，提高組織再生能力，促進局部炎癥消退。微波產(chǎn)熱快，受熱均勻且局限。組織細胞膜通透性增加，局部組織營養(yǎng)、代謝加快，白細胞的吞噬功能增加，機體免疫力增加，促進新陳代謝[8]。另外，微波輻射是一種電磁輻射，微波的非熱療效應可通過電磁場影響組織的分子結(jié)構(gòu)。生物體細胞內(nèi)外液中含有大量的帶電離子，極性和無極性分子在微波電場作用下發(fā)生振動和偏轉(zhuǎn)，組織內(nèi)溫度升高，毛細血管擴張，血液灌注量增加。組織細胞的營養(yǎng)供和細胞新陳代謝能力亦顯著提高。促進新肉芽的生長，同時對細胞功能和形態(tài)恢復的意義也很重大。大量具有免疫功能的相關分子聚集于炎癥組織，有效清除代謝產(chǎn)生的影響細胞正?；顒拥奈镔|(zhì)，調(diào)節(jié)局部的酸堿失衡?；謴图毎奈h(huán)境，達到消炎、消腫和除痛的療效。班燕欣等[8]用微波對DIO、OSSTEM、ITI3種類型種植體周圍炎進行治療，有效率達到95%左右，痊愈率達到90%。表明微波治療對不同種類的種植體周圍炎均有效。

病原微生物與局部刺激因素能引起牙周組織直接損傷，宿主持續(xù)存在的菌斑微生物的免疫應答所同時造成牙周組織的間接損傷[9]。LPS刺激巨噬細胞、成纖維細胞等之后，細胞合成并分泌IL-1、IL-6、IL-8，前列腺素及腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor，TNF）等多種炎性遞質(zhì)，最終將破壞牙周結(jié)締組織和導致牙槽骨吸收[10]。其中IL-6為多功能的細胞因子，許多活性與牙周炎發(fā)病機制都有相關性[10-12]。IL-6等細胞因子具有調(diào)控牙周疾病發(fā)生發(fā)展作用，在宿主反應過程中也至關重要，不但直接導致牙周組織的破壞，而且不斷的影響宿主的炎癥和免疫反應[13]。黃輝等[14]研究分析二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠炎癥因子IL-6表達的影響，結(jié)論認為二甲雙胍能降低實驗性糖尿病牙周炎大鼠IL-6的表達水平。

表1 低功率微波對人牙周膜細胞分泌IL-6 的影響（pg/mL，

注：對照組（僅含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基）、高劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照40 s）、中劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照20s）、低劑量組（10 μg/mL LPS ＋微波輻照10s）、模型組（10 μg/mL LPS）

輻照時間 對照組 模型組 低劑量組（10 s） 中劑量組（20 s） 高劑量組（40 s）輻照24 h 后 0.515±0.091 0.870±0.065 0.835±0.132 0.760±0.147 0.582±0.090輻照48 h 后 0.560±0.126 0.891±0.024 0.845±0.092 0.730±0.161 0.620±0.117

研究表明[15-17]，微波治療可以降低慢性牙周炎患者齦溝液中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及彈性蛋白酶的水平，對牙周炎有確切的治療作用。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗觀察微波輻照對LPS作用下HPDLCs中IL-6蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)模型組明顯高于對照組及高、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。這提示，相對于在LPS作用下IL-6高表達的正常牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament fibroblast，HPDLF），微波輻照顯著降低LPS作用下HPDLCs的IL-6表達，并且隨輻照劑量的增加，抑制IL-6的作用增強，這可能與微波能抑制炎癥狀態(tài)的牙周膜細胞增殖有一定關系。而低功率微波是否對LPS作用下HPDLCs的凋亡產(chǎn)生影響，從而影響IL-6的分泌，這可能需要更多的進一步研究探討。

綜上，本實驗結(jié)果認為微波輻照能夠顯著降低LPS作用下人牙周膜成纖維細胞IL-6的表達，臨床上選擇14 W低功率微波照射脂多糖誘導的人牙周膜細胞，隨輻照劑量的增加，抑制IL-6的作用增強。