硼酸對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化合成D-塔格糖的影響

李曉卉，繆 銘，沐萬(wàn)孟，江 波，張 濤

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122）

硼酸對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化合成D-塔格糖的影響

李曉卉，繆 銘，沐萬(wàn)孟，江 波*，張 濤

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122）

基于硼酸與構(gòu)型不同的單糖的絡(luò)合能力不同，探討了添加硼酸對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖異構(gòu)化為D-塔格糖的酶反應(yīng)體系的影響，研究了pH、溫度、硼酸加入量、加酶量等條件對(duì)硼酸作用的影響。結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)條件為pH9.0，溫度65℃，硼酸與底物的摩爾比1∶2，加酶量為0.39U/mL時(shí)，90g/L的底物D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率為50%，而不加硼酸時(shí)轉(zhuǎn)化率為27%，表明硼酸對(duì)反應(yīng)有很好的促進(jìn)作用。

硼酸，半乳糖，塔格糖，絡(luò)合

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（EC 5.3.1.4，L-arabinose isomerase，簡(jiǎn)稱 L-AI）是一種胞內(nèi)酶，可以催化L-阿拉伯糖與L-核酮糖之間的異構(gòu)化，也可以催化D-半乳糖異構(gòu)化為D-塔格糖。早期關(guān)于L-AI的研究都是與生物機(jī)體內(nèi)阿拉伯糖代謝相關(guān)，但目前該酶主要用于生物法工業(yè)化生產(chǎn)D-塔格糖。D-塔格糖是自然界中的一種稀有糖，是果糖在四位上的差向異構(gòu)體。作為一種具有特殊保健功能的功能性甜味劑[1]，其甜度是蔗糖的92%，并具有低能量、降血糖、抗齲齒、改善腸道菌群等生理功能[2]。2001年塔格糖被美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）確定為普遍公認(rèn)安全食品（GRAS）[3]。塔格糖的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化方法，目前生物轉(zhuǎn)化法用的最有效的酶為L(zhǎng)-阿拉伯糖異構(gòu)酶。目前已發(fā)現(xiàn)的可以利用L-AI生產(chǎn)D-塔格糖的菌株主要有[4-9]Esche-richia coli、Geobacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪地芽孢桿菌）、Thermoanaerobacter mathrani（i嗜熱桿菌）、Thermotoga maritima（海棲熱袍菌）、乳酸菌、Bacillus stearo ThermophilusUS100（嗜熱脂肪芽孢桿菌）等。硼酸是一種弱酸，四硼酸鈉（又稱硼砂）比硼酸穩(wěn)定，在稀溶液中，1分子的硼砂可以水解成4分子的硼酸，硼酸根離子在水溶液中以[B（OH）3]或者[B（OH）4]-1形式存在。在1925年，Hermans就發(fā)現(xiàn)含順式鄰二羥基的化合物與硼酸反應(yīng)可以得到兩種不同的化合物，即1∶1絡(luò)合物和1∶2絡(luò)合物[10]。水溶液中單糖一般以呋喃糖（五元環(huán)）或吡喃糖（六元環(huán)）的形式存在，構(gòu)型不同的單糖與絡(luò)合劑的結(jié)合力不同，從而形成穩(wěn)定性不同的絡(luò)合物，因此可以影響單糖之間的異構(gòu)化過(guò)程，改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)?；谶@種差異性絡(luò)合，研究探討了硼酸對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖的影響，并研究了反應(yīng)條件對(duì)單糖異構(gòu)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Escherichia coliBL21（DE3） 實(shí)驗(yàn)室自有保藏菌種；硼酸、四硼酸鈉（硼砂）、D-半乳糖、三羥甲基氨基甲烷等 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨1.0%、酵母提取物0.5%、NaCl1.0%，pH 7.0。

UV-2102紫外可見分光光度計(jì) 上海UNICO公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；SHA-2A冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1200系列高效液相色譜 Agilent公司；Sugarpark1糖柱 Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的制備 將含有可以表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的菌種E.coli BL21接種LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至合適菌體濃度后，加入一定量的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)酶12h，將培養(yǎng)液離心收集菌體。用pH7.0的Tris-HCl緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎，離心收集上清液，即為粗酶液，保藏于0～4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活及轉(zhuǎn)化率的測(cè)定酶活的測(cè)定：反應(yīng)體系為50mmol/L底物D-半乳糖，50mmol/L Tris-HCl（pH=7.0）緩沖液和適量酶液，75℃水浴振蕩反應(yīng)30min，沸水浴停止反應(yīng)，離心除去酶蛋白，將上清液適當(dāng)稀釋后，用半胱氨酸-咔唑法[11]測(cè)產(chǎn)物塔格糖的濃度，并計(jì)算酶活。所有反應(yīng)均以緩沖液代替酶液做空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次平行實(shí)驗(yàn)所得。

利用高效液相法測(cè)定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，HPLC的檢測(cè)條件為：流動(dòng)相：脫氣超純水；柱溫：85℃；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

酶活定義：以每分鐘催化D-半乳糖產(chǎn)生1μmol塔格糖的酶量為一個(gè)酶活單位U。

反應(yīng)轉(zhuǎn)化率（%）=產(chǎn)物D-塔格糖的濃度/反應(yīng)初始D-半乳糖濃度×100

相對(duì)轉(zhuǎn)化率（%）=轉(zhuǎn)化率/最高轉(zhuǎn)化率×100

1.2.3 硼酸的加入對(duì)半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響 配制一定濃度的不同pH的硼酸-硼砂緩沖液，按一定比例與D-半乳糖溶液混合，加入酶液后于混勻，置于一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間。不加硼酸的體系中的緩沖液用50mmol/L的Tris-HCl緩沖液代替。

1.2.3.1 pH對(duì)硼酸催化效果的影響 反應(yīng)體系為2mL，其中100mmol/L底物半乳糖（18g/L）、50mmol/L pH6.0～9.5硼酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液，75℃下振蕩反應(yīng)16h，沸水浴滅酶，離心后測(cè)上清液中的產(chǎn)物塔格糖濃度，以最高轉(zhuǎn)化率為100%計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.2 硼酸與半乳糖的摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響 在底物濃度為90g/L反應(yīng)體系中，加入不同摩爾量的pH 9.0硼酸緩沖液，使最終硼酸根離子與半乳糖的摩爾比分別為0∶1、1∶5、2∶5、1∶2、3∶5、4∶5、1∶1，75℃振蕩反應(yīng)16h。測(cè)定轉(zhuǎn)化率，以最高轉(zhuǎn)化率為100%計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率，并與50mmol/L Tris-HCl 7.0體系下反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率比較。

1.2.3.3 溫度對(duì)硼酸催化效果的影響 兩種反應(yīng)體系同上，分別在60、65、70、75℃下振蕩反應(yīng)16h，測(cè)定轉(zhuǎn)化率，并以最高轉(zhuǎn)化率為100%計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.4 不同加酶量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 反應(yīng)體系體積為2mL，其中90g/L底物半乳糖，50mmol/L pH9.0硼酸緩沖液（或pH7.0 Tris-HCl緩沖液），加入的酶量分別為0.15、0.27、0.39、0.50、0.62U/mL，在65℃水浴恒溫振蕩條件下反應(yīng)16h，測(cè)定轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同反應(yīng)條件對(duì)硼酸催化效果的影響

2.1.1 pH對(duì)硼酸催化效果的影響 由圖1可見，當(dāng)pH低于7.0時(shí)，在不含硼酸的Tris-HCl緩沖液中的轉(zhuǎn)化率略高于硼酸緩沖液反應(yīng)體系，Tris-HCl緩沖液中最適轉(zhuǎn)化pH為7.0；當(dāng)pH高于7.0時(shí)，硼酸體系下底物的轉(zhuǎn)化率開始高于Tris-HCl，并在9.0處達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率，為Tris-HCl緩沖液中的兩倍左右。隨著體系堿性的增強(qiáng)，硼酸的絡(luò)合作用逐漸增強(qiáng)，更多的產(chǎn)物塔格糖與硼酸絡(luò)合，促使反應(yīng)向生成塔格糖的方向轉(zhuǎn)移。一般認(rèn)為硼酸和單糖絡(luò)合在堿性條件下較好，Bonnerjea等人[12]研究認(rèn)為硼酸和單糖絡(luò)合的最佳pH為8.2左右。無(wú)硼酸存在時(shí)，實(shí)驗(yàn)所用的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適pH為7.0，堿性太強(qiáng)會(huì)影響酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其活性，減弱酶的催化作用。由圖1可見，存在硼酸時(shí)，堿性條件對(duì)反應(yīng)的促進(jìn)作用大于對(duì)酶的催化作用的抑制作用，但當(dāng)pH高于9.0后，轉(zhuǎn)化率開始下降，最終確定硼酸體系中最適轉(zhuǎn)化pH為9.0。

2.1.2 硼酸與半乳糖的摩爾比對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響如圖2所示，與第一個(gè)點(diǎn)即硼酸濃度為0的反應(yīng)體系相比，硼酸的加入使反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有了明顯的提高，當(dāng)硼酸根離子與半乳糖的摩爾比為1∶2時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高；當(dāng)硼酸量再增加時(shí)，產(chǎn)物量逐漸下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的硼酸量雖然可以絡(luò)合更多的糖，使反應(yīng)向生成塔格糖的方向進(jìn)行，但同時(shí)也會(huì)降低酶本身對(duì)異構(gòu)化的催化效果。

2.1.3 溫度對(duì)硼酸催化效果的影響 如圖3所示，在兩種反應(yīng)體系中，反應(yīng)都在65℃時(shí)達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率。這可能是因?yàn)镈-半乳糖到D-塔格糖的異構(gòu)反應(yīng)雖然在較高溫度下會(huì)向生成D-塔格糖的方向轉(zhuǎn)移，但是酶在較高的溫度下穩(wěn)定性較差，而且溫度越高，硼酸對(duì)酶的影響也越大。

2.1.4 不同加酶量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 從圖4可以看出，加酶量0.39U/mL為最適加酶量，再增加酶量，轉(zhuǎn)化率沒有明顯的增加，說(shuō)明酶與底物已經(jīng)基本飽和，多余的酶分子無(wú)法與底物結(jié)合。在兩種反應(yīng)體系中該趨勢(shì)相似，最適加酶量都為0.39U/mL，也說(shuō)明適量的硼酸對(duì)酶的催化活性影響不大。反應(yīng)16h后，沒有添加硼酸的反應(yīng)體系中D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率只有27%，有硼酸的體系轉(zhuǎn)化率接近50%，說(shuō)明硼酸的加入有效地提高了底物轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)論

本文研究了將硼酸加入到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶反應(yīng)體系中后，對(duì)D-半乳糖轉(zhuǎn)化成D-塔格糖的影響，研究得到最佳的反應(yīng)條件為pH9.0，溫度65℃，硼酸離子與半乳糖的摩爾比1∶2，加酶量為0.39U/mL，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0g/L時(shí)，在該最適條件下反應(yīng)16h后，D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率由27%提高到50%，說(shuō)明硼酸對(duì)塔格糖的生成有很大的促進(jìn)作用，有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

[1]Levin GV.Tagatose，the new GRAS sweetener and health product[J].J Med Food，2002（5）：23-36.

[2]Lu Y，Levin G V，Donner TW.Tagatose，a new antidiabetic and obesity controldrug.Iabetes[J].Obes Metab，2008，10（2）：109-134.

[3]FDA.Food labeling：health claims；D-tagatose and dental caries[M].Final rule http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.t_uids=12848171.

[4]Babu A，Manjasetty，Mark R.Chance crystal structure of.E.coli L-arabinose isomerase，the putative targetofbiologi-cal tagatose production[J].J Mol Bio，2006，360：297-309.

[5]Oh DK，Kim HJ，OhHJ，et al.Modification of optimal pH in L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus for D-galactose isomerization[J].JMol Catal B Enz-ym，2006，43：108-112.

[6]Jrgensen F，Hansen OC，Stougaard P.Enzymatic con-version of D-galactose to D-tagatose：heterologous expres-sion and characterisation of a thermostable L-arabinose isomerase from Thermoanaero bactermathranii[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，64：816-822.

[7]Lee DW，JangHJ，Choe EA，et al.Characterization of a thermostable L-arabinose isomerase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritime[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：1397-1404.

[8]Moez R， Rimeh I， Goran B， et al.The acid tolerant larabinose isomerase from the food grade Lactobacillus sakei 23K is an attractive D-tagatose producer[J].Bioresource Technology，2010，101：9171-9177.

[9]Rhimi M，Juy M，Aghajari N，et al.Probing the essen-tial catalytic residues and the substrate affinity in the ther-moactive Bacillus stearothermophilus US100 L-arabinose isomerase by site-directedmutagenesis[J].J Bacteriol，2007，189：3556-3563.

[10]錢國(guó)強(qiáng)，林雪，何炳林，等.硼酸與多羥基化合物的反應(yīng)及硼選擇性樹脂[J].離子交換與吸附，1994，10（4）：375-382.

[11]Dische Z，Borenfreund E.A new spectrophpotometric method for the detection and determination of ketose sugar and triose[J].J Biol Chem，1951，192：583-587.

[12]Bonnerjea J，Jackson J，Hoare M，et al.Affinity flocculation of yeast cell debris by carbohydrate-specific compounds[J].Enzyme Microb Technol，1988，10（6）：359-360.

Production of D-tagatose using L-arabinose ismoerase through addition of boric acid

LI Xiao-hui，MIAO Ming，MU Wan-meng，JIANG Bo*，ZHANG Tao
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Based on different affinities of boric acid to D-galactose and D-tagatose，an L-arabinose ismoerase mutant enzyme was used to catalyze the isomerization of D-galactose to D-tagatose with boric acid.The effect of pH，temperature，molar ratio of boric acid and the enzyme addition was studied.The results showed the optimum conditions for production of D-galactose were pH 9.0，65℃，1∶2 molar ratio of boric acid to D-galactose，the amounts of enzyme was 0.39U/mL.Under this condition，in 16h，the convertion was 50%when the concentration of D-galactose was 90g/L with boric acid，while 27%in the Tris-HCl buffer system without borate，which showed that boric acid had good impact on the production of D-tagatose.

boric acid；galactose；tagatose；complexing

TS201.2

A

1002-0306（2012）11-0315-03

2011－08－01 * 通訊聯(lián)系人

李曉卉（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品酶技術(shù)。

江蘇省社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目（BE2010626，BE2011622和BE2011766）。