高通量測序技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用＊

張春蘭

（濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

第一代測序技術(shù)是Sanger等于1970年代發(fā)明的雙脫氧測序法，在過去的30多年中一直在DNA測序領(lǐng)域占據(jù)著主要地位。高通量測序技術(shù)又稱為深度測序技術(shù)、新一代測序技術(shù)或第二代測序技術(shù)。新一代測序技術(shù)可通過聚合酶或連接酶進(jìn)行體外合成測序。相對于傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)，具有通量更高、運行時間更短、測序片段更長、花費更少等優(yōu)點。高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，將生物學(xué)在基因水平的研究帶入了一個新的時期。高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)模基因組測序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA分析、表觀遺傳學(xué)分析等相關(guān)研究。

1 高通量測序技術(shù)在DNA水平的應(yīng)用

1.1 未知基因組序列的全基因組從頭測序

全基因組測序?qū)θ媪私庖粋€物種的分子進(jìn)化、基因組成和基因調(diào)控等有著非常重要的意義。新一代測序技術(shù)極大地推動了各物種的全基因組測序工作，越來越多的物種基因組信息相繼公布。全基因組從頭測序指利用測序平臺對某物種進(jìn)行測序，然后從頭組裝數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫比對統(tǒng)計進(jìn)行基因作圖、與性狀的關(guān)聯(lián)分析、不同組織或材料間基因差異表達(dá)分析等，并最終完成基因組作圖。Li等首次在動物方面完全運用高通量測序技術(shù)模式完成了大熊貓基因組從頭測序的組裝，測序深度達(dá)73倍，覆蓋約94%的基因組區(qū)域，組裝形成了大熊貓的基因組草圖[1]。Rasmusse等從4000年前愛斯基摩托人的一束頭發(fā)中提取DNA，利用Solexa進(jìn)行全基因組測序，得到大約79%的序列[2]。Dalloul等聯(lián)合多個測序平臺（454測序平臺完成5倍測序深度、Illumina GAⅡ測序平臺完成20倍測序深度、Sanger技術(shù)完成6倍覆蓋度）完成了火雞基因組的從頭測序[3]。Jared等利用全基因組測序?qū)σ患宜目冢ǜ改讣捌浜⒆樱┻M(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了影響人類自發(fā)性基因突變的平均速度，以及一些與影響兄弟姐妹疾病有關(guān)的基因[4]。到目前為止，NCBI上公布的已測序物種有人、小鼠、大鼠、牛等19種動物，擬南芥、水稻、大豆、隱藻4種植物以及其他真菌和原生生物。

1.2 已知基因組序列的重測序

對已知基因組物種進(jìn)行重測序是第二代測序技術(shù)目前應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域。通過重測序，可以將測序數(shù)據(jù)與已有基因組信息相比對，發(fā)現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)變異、單核苷酸多態(tài)性、群體多態(tài)性、突變熱點等，從而進(jìn)行輔助分子育種、遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因預(yù)測等。中科院上海生命中科學(xué)院、北京基因組所等六家科研機構(gòu)共同對150個水稻RIL系進(jìn)行重測序，第一次利用全基因組重測序篩選水稻SNP位點，對群體進(jìn)行表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)了122萬多個SNPs[5]。Rubin等通過全基因組重測序?qū)?個家雞品系和1個野生品系進(jìn)行測序，分析雞馴養(yǎng)過程中的位點選擇，發(fā)現(xiàn)了7000多萬個SNPs，約1300多個插入／缺失位點[6]。利用對不同條件下或不同表型的樣本進(jìn)行重測序，也可在個體或群體水平進(jìn)行差異性分析、遺傳疾病分析等。William等對一名煙齡超過15年，平均每天吸煙25根的原發(fā)性肺部腫瘤患者進(jìn)行分析，將該患者的癌組織與相鄰正常組織的基因組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了超過5萬個基因點突變，并且確認(rèn)有392個在編碼區(qū)域[7]。

1.3 宏基因組學(xué)研究

宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）測序是近年來提出的一種新概念，目前主要用于微生物的研究中。是指直接從環(huán)境中提取所有物種的DNA進(jìn)行全基因組測序。即不再進(jìn)行分離，而是從整體上研究整個微生物種群結(jié)構(gòu)的特征，研究對象從單一基因組發(fā)展到基因組集合。與傳統(tǒng)的微生物研究相比，宏基因組不再局限于實驗室培養(yǎng)，更真實地接近于大自然生態(tài)群落和復(fù)雜性和多樣性，對人類更好地了解微生物群落有著重要的意義。

2 高通量測序技術(shù)在RNA水平的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）

RNA-Seq技術(shù)能夠在單核苷酸水平對特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測，從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：

（1）檢測新的轉(zhuǎn)錄本。Marten J?ger等比較了綿羊的正常組和骨延遲愈合組的基因表達(dá)譜，與綿羊基因組比對后發(fā)現(xiàn)了12431個新的轉(zhuǎn)錄本[8]。Huang W等比較了不同發(fā)育時期牛胚胎的轉(zhuǎn)錄本，與牛基因組比較后發(fā)現(xiàn)了1785個新的轉(zhuǎn)錄本[9]。

（2）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達(dá)量、不同樣本間差異表達(dá)。李新建在其博士論文中比較了榮昌豬和長白豬的轉(zhuǎn)錄本，篩選出1596個差異表達(dá)顯著的基因[10]。

（3）基因功能注釋。將所測reads與已有數(shù)據(jù)庫（如GO、KEGG）已注釋功能的基因相比對分析，從而揭示特定轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下的基因的功能和生物通路等。Ajai K等采用454測序平臺對牛角癌組織和正常角組織轉(zhuǎn)錄本分析，并對909345個轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了GO和KEGG分析[11]。

（4）轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、RNA編輯、基因融合等。轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的變異能揭示基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的多樣性?？勺兗艚邮挂粋€基因產(chǎn)生多個mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而翻譯成不同的蛋白。Sergei A等對擬南芥的RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)至少有約42%含有內(nèi)含子的基因進(jìn)行了可變剪切[12]。RNA編輯通過堿基的替換或轉(zhuǎn)換等使基因序列發(fā)生改變。Peng Z Y等通過對一個漢族男性約76700萬個轉(zhuǎn)錄表達(dá)序列分析，發(fā)現(xiàn)在22688個在非編碼基因、內(nèi)含子、非翻譯區(qū)和蛋白編碼基因的編碼序列中存在RNA編輯，為后期的實驗制作了一個綜合性的RNA編輯組圖譜[13]。基因融合是最近利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序研究的一個新的內(nèi)容，主要在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)。Shancheng Ren等對14個中國漢族人的原發(fā)性前列腺癌和他們的正常組織進(jìn)行RNA-seq分析，揭示前列腺癌的基因融合、長非編碼RNA、可變剪切和體細(xì)胞突變的多樣性[14]。

（5）開發(fā)SNPs和SSR等。通過比對轉(zhuǎn)錄本和參考基因組間的序列，尋找潛在的SNPs或SSRs。Stephen B等對HapMap中60個歐洲后代進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，開發(fā)了901個人基因組上的的cSNP（編碼SNP）[15]。Angela Ca′novas等對荷斯坦奶牛乳樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，開發(fā)了33045個具有多態(tài)性的cSNPs[16]。

2.2 小分子RNA測序

近年來研究發(fā)現(xiàn)小分子RNA是一類主要存在于真核生物體內(nèi)的特殊的內(nèi)源性調(diào)控序列。長度范圍在18-27nt，進(jìn)化上高度保守。目前認(rèn)為主要通過與靶基因配對結(jié)合抑制基因翻譯，或影響基因的降解來調(diào)控基因表達(dá)。自從1993年首次在秀麗線蟲（Caenorhadits，elegans）中被發(fā)現(xiàn)以來[17]，人們越來越意識到小分子RNA的重要作用。人們開始采用大規(guī)模平行標(biāo)簽測序技術(shù)、454-FLX、Solexa／Illumina測序技術(shù)為代表的新型焦磷酸高通量測序技術(shù)來發(fā)掘生物體內(nèi)的大量小分子RNA。并隨著技術(shù)的逐漸升級，使得測序深度更深、費用更低、速度更快。高通量測序既能捕捉到真實存在的小RNA，甚至是體內(nèi)表達(dá)量很低的小RNA，同時也能對沒有注釋的小片段RNA進(jìn)行預(yù)測。

3 表觀遺傳學(xué)研究

3.1 甲基化研究

DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的另一種廣泛而重要的方式。它通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用，從而控制基因的表達(dá)。對甲基化位點及方式的研究，近年來也發(fā)展了多種方法，如甲基轉(zhuǎn)移酶法、免疫化學(xué)法、氯乙醛法、直接測序法、甲基化特異性的PCR法、DNA微陣列法等。利用高通量測序法在全基因組范圍內(nèi)檢測甲基化位點是近年來發(fā)展起來的一種方法。目前已建立了至少三種依賴于高通量測序的DNA甲基化分析技術(shù)：甲基化DNA免疫共沉淀測序[18]、甲基結(jié)合蛋白測序和亞硫酸氫鹽測序[19]。高通量測序已應(yīng)用于擬南芥[19]、水稻[20]、人[21]等生物 DNA甲基化的研究，取得了豐碩的成果，并逐步應(yīng)用于各種生物體上。

3.2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點研究

轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA特定區(qū)域相結(jié)合，開啟或關(guān)閉基因的表達(dá)以達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)目的。染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）是目前研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的最為經(jīng)典的一種實驗技術(shù)，廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾、特定轉(zhuǎn)錄因子的基因調(diào)控作用等相關(guān)領(lǐng)域。其基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。自從2007年應(yīng)用該技術(shù)獲得的科研成果分別在Science[22]、Nature[23]和 Cell[24]等頂級刊物上發(fā)表以來，利用該技術(shù)揭示蛋白因子作用位點的文章如雨后春筍般出現(xiàn)在各種刊物和雜志上。

4 結(jié)束語

分子生物學(xué)的發(fā)展離不開測序技術(shù)，自從1977年Sanger測序法的問世到近年來高通量測序法的廣泛應(yīng)用，相繼揭秘了大量的遺傳信息。但是，第二代高通量測序技術(shù)還處于起步階段，由于測序費用仍很昂貴、測序長度也受到限制、信息平臺尚未完善等原因，使得該技術(shù)的應(yīng)用受到了一定的限制。相信隨著測序技術(shù)的逐步改進(jìn)，高通量測序?qū)⒊蔀橐豁棇嶒炇页Ｒ?guī)手段，為生物學(xué)的分子研究帶來革命性的變革。

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