高效液相色譜法同時(shí)測定氫達(dá)乳膏中三組分含量

丁志軍，李小蘭,付志媛

1.江西省皮膚病專科醫(yī)院，江西 南昌 330001；2.江西省皮膚病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江西 南昌 330001；3.國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心建設(shè)單位，江西 南昌 330001

氫達(dá)乳膏是由鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松、白凡士林、平平加A-20、枸櫞酸、甘油、水等組成的水包油型乳膏劑，收錄于2020 年版《江西省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)程》，具有止痛、止癢作用，主要用于皮炎、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛等，療效確定［1］。原標(biāo)準(zhǔn)中制劑含量測定項(xiàng)采用氯化三苯四氮唑比色法［2］控制氫化可的松用量，不僅方法專屬性差，而且樣品處理步驟復(fù)雜繁瑣、操作過程十分耗時(shí)，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不理想，準(zhǔn)確性不好、重現(xiàn)性差。對(duì)抑菌劑羥苯乙酯未建立質(zhì)量控制方法。文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，羥苯乙酯用量應(yīng)達(dá)到抑菌有效量；同時(shí)其有效濃度應(yīng)不超過對(duì)人體的有害濃度。為此，本文對(duì)氫達(dá)乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松3 種主要成分的含量測定方法進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，DAD 檢測器）；BT-125D Sartorius 電子天平（德國）；UV-1800 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥

鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100423-201102，含量99.8%）；羥苯乙酯對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100847-201604，含量99.9%）；氫化可的松對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100152-201707，含量99.2%)；甲醇(色譜純，Merck 公司)；水(重蒸餾水，江西省皮膚病?？漆t(yī)院制劑室)；其余試劑均為分析純；氫達(dá)乳膏（江西省皮膚病?？漆t(yī)院制劑室，批號(hào)210201、210301、210401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液（含0.2%枸櫞酸和0.2%磷酸氫二鈉)-甲醇（34∶66）為流動(dòng)相；流速為0.6 mL/min；柱溫為25 ℃；檢定波長：256 nm；進(jìn)樣體積為5 μL。理論塔板數(shù)按鹽酸達(dá)克羅寧峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備分別取鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品、羥苯乙酯對(duì)照品、氫化可的松對(duì)照品適量，精密稱定，加枸櫞酸乙醇液（含0.12‰枸櫞酸）溶解并稀釋制成每1 mL 分別含61.920、6.044、60.288 μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸達(dá)克羅寧3 mg、羥苯乙酯0.3 mg、氫化可的松3 mg），精密稱定，放置于50 mL 容量瓶中，加入一定量95%乙醇，放置于70 ℃水浴中加熱大約5 min，振動(dòng)搖晃量瓶使乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯及氫化可的松溶解，放涼至室溫后，用95%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，放置于冰箱中冷藏2 h以上，取出，用濾紙快速濾過，收集續(xù)濾液放至室溫，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備取按氫達(dá)乳膏處方工藝方法制備的缺鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松的陰性樣品適量，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法要求同法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取按對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5 μL 注入液相色譜儀，采用上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品色譜圖在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的鹽酸達(dá)克羅寧峰、羥苯乙酯峰、氫化可的松峰，而陰性對(duì)照色譜圖在相應(yīng)位置上無色譜峰干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性對(duì)照溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取氫化可的松對(duì)照品18.84 mg、鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品19.35 mg，置25 mL 量瓶中，加含0.12‰枸櫞酸乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得母液Ⅰ；取羥苯乙酯對(duì)照品15.11 mg，精密稱定，置200 mL 量瓶中，加含0.12‰枸櫞酸乙醇溶液溶解后，再用該乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得母液Ⅱ；精密吸取母液Ⅰ 1 mL、2 mL、3 mL、3 mL、5 mL，分別置25 mL、25 mL、25 mL、50 mL、50 mL 量瓶中，再精密吸取母液Ⅱ 1 mL、2 mL、3 mL、3 mL、5 mL，分別置上述量瓶中，加含0.12‰枸櫞酸乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得，采用上述“2.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件，分別精密吸取各溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定各峰峰面積，以各峰峰面積為縱坐標(biāo)，各溶液進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，鹽酸達(dá)克羅寧的回歸方程為：Y=1 869.896 6X+2.830 0，線性范圍為0.155～0.464 μg（r=0.999 8）；羥苯乙酯的回歸方程為：Y=8 944.531 2X+2.124 8，線性范圍為0.015～0.045 μg（r=0.999 8）；氫化可的松的回歸方程為：Y=2 989.251 6X+5.500 0，線性范圍為0.151～0.452 μg（r=0.999 8）。

2.5 檢出限

取鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品、羥苯乙酯、氫化可的松對(duì)照品適量，用枸櫞酸乙醇液（含0.12‰枸櫞酸）溶解并逐級(jí)稀釋后測定，鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松的檢出限（3 S/N）分別為0.396 ng、0.058 ng、0.235 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，采用上述“2.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件，注入高效液相色譜儀，同法連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松平均峰面積值，RSD 分別為0.96%、0.78%、1.01%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8 h采用上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μL，測得鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松平均峰面積值，RSD 分別為0.66%、0.87%和0.92%，結(jié)果表明鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)210201）6 份，采用萬分之一分析天平分別精密稱定重量，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法要求同法制備供試品溶液，采用上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，測得各峰峰面積值，分別計(jì)算制劑氫達(dá)乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松含量，RSD 分別為0.92%、0.83%、0.58%，結(jié)果表明，此法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品（批號(hào)210201）6 份，精密稱定，分別精密加入一定量的羥苯乙酯、氫化可的松、鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品，采用“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測定

取樣品3 批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，按外標(biāo)法計(jì)算氫達(dá)乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松標(biāo)示量的百分含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

比較了含三乙胺的醋酸-醋酸銨緩沖液-甲醇［5］、枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液-甲醇［6］兩種流動(dòng)相體系，結(jié)果醋酸-醋酸銨緩沖液（含三乙胺）-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，三乙胺的加入雖對(duì)鹽酸達(dá)克羅寧峰拖尾現(xiàn)象有所改善，但同時(shí)液相色譜柱的柱效也下降明顯。而以枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液（含0.2%枸櫞酸和0.2%磷酸氫二鈉)-甲醇（34∶66）為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松色譜峰峰形對(duì)稱（拖尾因子在0.90～1.10之間），分離度良好，柱效均較高。故流動(dòng)相最終選擇枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液-甲醇體系。

3.2 檢測波長的選擇

取鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松混合對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀（DAD 檢測器），采集在190～400 nm 波長范圍內(nèi)光譜，從鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯和氫化可的松的最大吸收波長分別為282、256、244 nm，因處方中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯和氫化可的松的含量比為10∶1∶10，為了兼顧三者的檢測靈敏度，經(jīng)試驗(yàn)摸索，最終選定測定波長為256 nm。

3.3 溶劑、提取溫度及提取時(shí)間的考察

鹽酸達(dá)克羅寧可溶于乙醇，略溶水中［7］；羥苯乙酯易溶于甲醇、乙醇，幾乎不溶于水中；氫化可的松略溶于乙醇，不溶于水中［8-9］。據(jù)此，在試驗(yàn)之初，我們以乙醇為溶劑制備對(duì)照品溶液及樣品溶液，但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液中鹽酸達(dá)克羅寧含量下降較快，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10-11］，因此，我們嘗試在乙醇中加入酸以增加鹽酸達(dá)克羅寧的穩(wěn)定性，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枸櫞酸乙醇溶液（含0.12‰枸櫞酸）能顯著增加其穩(wěn)定性，因此，選擇枸櫞酸乙醇液（含0.12‰枸櫞酸）為溶劑制備對(duì)照品溶液。同時(shí)我們也對(duì)樣品溶液制備時(shí)的提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)水浴溫度為70 ℃時(shí)，提取5 min 能將乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧、羥苯乙酯、氫化可的松提取完全。