鈣網(wǎng)蛋白與抗腫瘤免疫的相關(guān)性研究新進(jìn)展

熊輝強(qiáng) 綜述，李 黎，張少容審校

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006）

有研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞表面攜帶了自我毀滅的種子——鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT），其可發(fā)送信號(hào)招募吞噬細(xì)胞吞噬并消化這些腫瘤細(xì)胞，達(dá)到徹底清除腫瘤細(xì)胞的功效。CRT可作為某些腫瘤細(xì)胞表面一種有效的促吞噬信號(hào)，通過(guò)結(jié)合吞噬細(xì)胞表面的低密度脂蛋白－相關(guān)蛋白受體（lowdensity lipoprotein－related protein，LRP）使腫瘤細(xì)胞被吞噬，引起機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)［1］。CRT具有多種生物學(xué)功能，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，在抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有望成為抗腫瘤免疫治療新途徑?，F(xiàn)將CRT生物學(xué)功能、表達(dá)、調(diào)控及其與抗腫瘤免疫的相關(guān)性研究新進(jìn)展作一綜述。

1 CRT的生物學(xué)功能及其表達(dá)

CRT是一種相對(duì)分子質(zhì)量為4.6×104DaCa2＋結(jié)合蛋白，主要位于非肌細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌質(zhì)網(wǎng)中，由人19號(hào)染色體上單一基因編碼，包含9個(gè)外顯子，具有高度的進(jìn)化保守性［2］。CRT具有多種功能，參與伴侶分子活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2＋環(huán)境平衡的調(diào)節(jié)，細(xì)胞間黏附信號(hào)的調(diào)控，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊和低聚反應(yīng)過(guò)程中黏蛋白的合成，以及抑制血管生成和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［3－4］。此外，CRT在主要組織相容性復(fù)合體I（major histocompatibility complex I，MHC－I）的組合、類固醇介導(dǎo)的基因的調(diào)節(jié)以及Zn2＋的結(jié)合和儲(chǔ)存中起重要作用［5］。細(xì)胞核中的CRT能調(diào)節(jié)核蛋白遷移和影響信號(hào)經(jīng)由核甾體激素受體和整聯(lián)蛋白［6］。當(dāng)用蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉑、放射治療及缺氧等處理，細(xì)胞表面的CRT暴露，并成為一種“來(lái)吃我”信號(hào)，招募樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）和巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致免疫反應(yīng)［7－8］。CRT 還與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，通過(guò)增加細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附能力［9］或者減少 MHC－I類抗原提呈發(fā)揮作用［10］。

CRT的表達(dá)已經(jīng)在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌［11－14］等。Chao等［15］研究表明，CRT主要表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的表面，前者主要包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）、急性淋巴細(xì)胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性髓細(xì)胞白血?。╟hronic myelognous leukemia，CML）和非霍奇金淋巴瘤（non－Hodgkin’s lymphoma，NHL），以及實(shí)體瘤中的惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌和卵巢癌等，但是在對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中卻很少表達(dá)。以往的研究還表明CRT亦存在于有活性的外周血T細(xì)胞和循環(huán)中的中性粒細(xì)胞［16］。

2 CRT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制

CRT正常位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其在細(xì)胞中發(fā)揮促吞噬信號(hào)功能需要經(jīng)過(guò)系列的途徑遷移至胞膜，并與ERp57以分子絡(luò)合物的形式共同表達(dá)于細(xì)胞膜表面發(fā)揮作用。CRT暴露遷移途徑復(fù)雜，涉及的調(diào)控機(jī)制：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticu－lum，ER）應(yīng)激性原理、細(xì)胞凋亡機(jī)制（caspase－8及其底物BAP31、Bax、Bak）、蛋白從ER至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及 N－甲基馬來(lái)酞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble NSF attachment protein receptors，SNAREs）相關(guān)的胞吐作用等。

2.1 ER應(yīng)激性原理 在Kepp等［17］的研究中，用蒽環(huán)類抗生素、奧沙利鉑（抗腫瘤藥）或者電離照射治療一段時(shí)間的鼠CT26細(xì)胞、人類HCT－16結(jié)腸癌細(xì)胞，以及人類Hela頸部癌細(xì)胞和鼠胚胎性成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CRT能夠暴露于這些細(xì)胞的表面，該作用是伴隨ER超微結(jié)構(gòu)的破壞以及ER應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)的產(chǎn)生，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固定激酶PERK激活，真核起始因子（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）則變成了磷酸化的絲氨酸－51，并轉(zhuǎn)化成一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子eIF2β的抑制劑，從而影響CRT蛋白合成。同樣地，敲除PERK也能廢除CRT暴露。因此，CRT的暴露需要PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化作用。而Novoa等［18］研究表明，ER應(yīng)激還能產(chǎn)生一種由2個(gè)亞單位構(gòu)成的GADD34抑制劑，通過(guò)與蛋白磷酸酶－1（PP1）的相互作用來(lái)介導(dǎo)eIF2α磷酸化過(guò)程，影響CRT的暴露途徑。

2.2 細(xì)胞凋亡機(jī)制 有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面CRT的表達(dá)能被一般的半胱天冬酶（caspase）抑制劑所抑制，例如化學(xué)合成的假底物Z－VAD－fmk或者桿狀病毒編碼的p35蛋白［19］。相應(yīng)地，敲除PERK能廢除由蒽環(huán)類抗生素誘導(dǎo)的caspase－8的蛋白水解成熟過(guò)程。敲除caspase－8基因（而不是caspase－3，7，12）能廢除CRT的暴露。然而在caspase－8－／－MEFs顯示出正常的PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化，表明PERK位于caspase－8的上游區(qū)。caspase－8需要降解其底物BAP31發(fā)揮作用，BAP31是一種 Bcl－2結(jié)合蛋白［20］。當(dāng)用無(wú)裂解的 D164A／D238ABAP31突變體轉(zhuǎn)染Hela癌細(xì)胞后丟失了CRT遷移能力，敲除BAP31類似于廢除CRT暴露。Bcl－2是細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著性的抑制劑，能阻礙促吞噬因子的Bax和Bak的活性［21］。在MEFs中敲除Bax或者Bak中的任何一個(gè)，或者在Hela和CT26細(xì)胞中敲除Bax、Bak蛋白均能廢除CRT的暴露。由此可見(jiàn)，caspase－8及其裂解底物BAP31、Bax、Bak都是CRT暴露所必須的。

2.3 蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)與胞吐作用 CRT的暴露需經(jīng)過(guò)ER至高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，CRT蛋白以小囊泡形式從高爾基體發(fā)出，與細(xì)胞膜融合，并以SNAREs依賴的胞吐方式分泌。布雷菲德菌素A（brefeldin A），一種順行蛋白從ER至高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑，能阻斷由蒽環(huán)類抗生素誘導(dǎo)的CRT暴露，敲除SNAREs同樣能抑制CRT暴露。表明蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和胞吐作用對(duì)于CRT釋放起重要作用。

2.4 ERp57 ERp57是一種固著的二硫化物異構(gòu)酶，能在ER內(nèi)相互干擾CRT，共同轉(zhuǎn)移CRT至細(xì)胞表面，應(yīng)對(duì)免疫原性的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)。敲除了ERp57能完全廢除CRT暴露，反之亦然，敲除CRT也能抑制ERp57暴露。用特異性ERp57逆轉(zhuǎn)錄RNA干擾的腫瘤細(xì)胞可減少ERp57表達(dá)，再用蒽環(huán)類藥物處理只表現(xiàn)正常的凋亡，ERp57低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞不能引起CRT的移位。表明CRT與ERp57的相互作用是共遷移到細(xì)胞表面所必需的。Obeid［22］研究顯示，CRT的表達(dá)受到ERp57表達(dá)的控制，敲掉ERp57可抑制CRT的表達(dá)并被樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬，從而消除了免疫原性，敲掉CRT或缺乏CRT可消除ERp57的表達(dá)，給予重組ERp57并不能恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的免疫原性（與v重組CRT不同），ERp57通過(guò)控制CRT的表達(dá)來(lái)控制腫瘤細(xì)胞的免疫原性。

3 CRT與抗腫瘤免疫

有效地抗腫瘤治療不單是殺死腫瘤細(xì)胞，更重要的是建立抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞表面CRT的表達(dá)能招募DCs和吞噬細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Xu等［23］研究發(fā)現(xiàn)，CRT不僅能夠結(jié)合E7有效地促進(jìn)DCs提呈E7抗原、誘導(dǎo)抗原特異性CD8－T細(xì)胞，還能促使白細(xì)胞介素（IL）－2、IFN－γ分泌，進(jìn)而活化吞噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞，促使CTL增殖及抗腫瘤免疫作用。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制逃避免疫攻擊而抵抗機(jī)體的免疫清除。最近有研究表明，腫瘤細(xì)胞通過(guò)下調(diào)促吞噬信號(hào)的CRT表達(dá)是細(xì)胞逃避吞噬反應(yīng)的另外一種機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制腫瘤細(xì)胞可以逃避免疫監(jiān)視。若能對(duì)某些因低水平表達(dá)CRT引起的腫瘤免疫逃避反應(yīng)增加其細(xì)胞表面CRT的表達(dá)則能重新引起機(jī)體的抗腫瘤免疫，使腫瘤細(xì)胞被清除。Panaretakis等［24］研究發(fā)現(xiàn)，用蒽環(huán)類抗生素——米托蒽醌（MTX）治療高水平表達(dá)CRT／ERp57的鼠CT26癌細(xì)胞移植瘤時(shí)其能被治愈，而移植低水平表達(dá)CRT／ERp57的CT26癌細(xì)胞的小鼠移植瘤卻未能被治愈。對(duì)于后者，當(dāng)其瘤體內(nèi)注射重組體CRT蛋白時(shí)又能使小鼠被治愈。因?yàn)樽⑸渲亟M體CRT蛋白后，其能吸附至腫瘤細(xì)胞表面，相當(dāng)于增加了腫瘤細(xì)胞表面CRT的表達(dá)。為了證明細(xì)胞表面增加CRT表達(dá)能否促使吞噬作用進(jìn)行了體外吞噬實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞（normal bone marrow，NBM）中添加外源性重組體CRT蛋白，與對(duì)照組比較，用外源性CRT培養(yǎng)的NBM能夠促使巨噬細(xì)胞的吞噬作用。這些結(jié)果表明機(jī)體的抗腫瘤免疫功能的發(fā)揮需要細(xì)胞表面CRT的存在。

Chao等［15］研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞“促吞噬信號(hào)”CRT的表達(dá)常伴有“抗吞噬信號(hào)”CD47的表達(dá)，以此來(lái)防護(hù)CRT介導(dǎo)的吞噬作用。當(dāng)CRT－阻斷肽阻斷靶細(xì)胞表面CRT與吞噬細(xì)胞表面的受體LRP間的相互作用，吞噬活性被完全廢除，從而引起腫瘤的免疫逃避。同樣地，若能下調(diào)“抗吞噬信號(hào)”CD47的表達(dá)水平，此時(shí)相當(dāng)于上調(diào)了CRT的水平，則同樣能引起吞噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的吞噬作用。為了證明這一假說(shuō)，他們用慢病毒－shRNAs敲除Raji細(xì)胞（一種Burkitts NHL細(xì)胞系）中CD47基因的表達(dá)，細(xì)胞表面CRT的表達(dá)沒(méi)有受shRNA介導(dǎo)的CD47基因敲除的影響，當(dāng)其置于人類吞噬細(xì)胞中一起培養(yǎng)，與對(duì)照組比較，Raji細(xì)胞能大量被人類吞噬細(xì)胞吞噬。當(dāng)用抗－CD47單克隆抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的CD47分子，同樣能使腫瘤細(xì)胞中的抗吞噬信號(hào)（CD47）被抑制，暴露出促吞噬信號(hào)（CRT），促使了吞噬細(xì)胞的吞噬作用。從上述研究可見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞表面CRT和CD47的平衡表達(dá)，對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫起重要的作用。CRT作為多種人類癌癥組織中的主要促吞噬信號(hào)，為用重組體CRT及沉默CD47基因?qū)δ[瘤的靶向治療提供依據(jù)。

Peng等［25］研究表明，結(jié)腸癌中CRT的表達(dá)和CD45RO＋T細(xì)胞的浸潤(rùn)密切相關(guān)，與CD3＋T細(xì)胞的浸潤(rùn)及患者的其他參數(shù)（年齡、性別、腫瘤位置）無(wú)相關(guān)性。CD45RO＋T細(xì)胞為一種記憶性T細(xì)胞，其表面黏附分子表達(dá)強(qiáng)，能直接向抗原部位移動(dòng)，當(dāng)再次抗原刺激時(shí)，即刻發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［26］。CD45RO＋T細(xì)胞在結(jié)直腸癌組織中的浸潤(rùn)，能減緩腫瘤的進(jìn)展［27］。CRT的抗腫瘤免疫功能可能與刺激CD45RO＋T細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)有關(guān)。尚需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)并發(fā)現(xiàn)其相關(guān)作用機(jī)制。

4 展 望

腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素就是突變的腫瘤細(xì)胞能夠下調(diào)一些分子的表達(dá)來(lái)逃避免疫反應(yīng)，而這些分子在細(xì)胞識(shí)別和吞噬過(guò)程中起重要的作用［28］。期望通過(guò)改變細(xì)胞表面相關(guān)分子的表達(dá)來(lái)恢復(fù)或者刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)，以此來(lái)完成一種有效的腫瘤預(yù)防和治療。CRT作為某些惡性腫瘤組織中的主要“促吞噬信號(hào)”，其在腫瘤細(xì)胞中的移位暴露引發(fā)了免疫反應(yīng)，為抗腫瘤傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合免疫治療提供新的契機(jī)。CRT的促吞噬作用能被細(xì)胞表面“抗吞噬信號(hào)”的CD47分子所抵抗，敲除CD47基因或者用抗－CD47單克隆抗體療法同樣可以達(dá)到治療效果，表明腫瘤免疫過(guò)程中促吞噬和抗吞噬信號(hào)平衡表達(dá)的重要性。其他惡性腫瘤組織中是否均存在CRT的表達(dá)，其如何與CD47共同作用于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及其相關(guān)作用機(jī)制，這些都亟待進(jìn)一步的深入研究。

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