ERIC-PCR技術(shù)臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

王 芳，倫永志

（1. 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622）

從原核生物到真核生物，基因組中重復(fù)序列的數(shù)目呈遞增趨勢。重復(fù)序列的作用目前還不完全清楚，但重復(fù)序列不是冗余或者“無用”DNA，而是與生物的進(jìn)化、遺傳和變異密切相關(guān)，同時(shí)它還對基因表現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體構(gòu)建及生理代謝都起著極其重要的作用[1]。1990年，Sharples等[2]在分析大腸埃希菌（Escherichia coli）基因組中tsl基因的3'端時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種基因間重復(fù)序列，命名為“基因間重復(fù)序列”（intergenic repetitive unit，IRU）。之后 Hulton等[3]在鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、假結(jié)核耶爾森菌（Yersinia pseudotuberculosis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）基因組中也發(fā)現(xiàn)了同樣高度保守的重復(fù)序列。由于該序列主要存在于腸桿菌科細(xì)菌中，故稱之為“腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列”（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC）。ERIC是諸多重復(fù)序列中的一種。針對ERIC建立起來的PCR技術(shù)已廣泛使用，本文著重對ERIC-PCR技術(shù)臨床應(yīng)用現(xiàn)狀做一綜述。

1 ERIC-PCR技術(shù)

ERIC長約127bp，其中包含幾個(gè)反向重復(fù)序列，具有非常保守的中央倒置重復(fù)區(qū)，有的還有插入序列。ERIC散在分布在細(xì)菌基因組中，尚未在噬菌體和質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)[4]。人們在研究 ERIC（IRU）時(shí)多采用Hulton提出的序列，有所不同的是在第127位加上堿基“A”[5]。ERIC-PCR技術(shù)是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）檢測技術(shù)上建立起來的，本質(zhì)上是一種長引物的 RAPD技術(shù)。Versalovic等[6]以ERIC中部反向重復(fù)序列為結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一組反向引物（ERIC1R 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’；ERIC2 5’-AAGTAAGTGACT GGGGTGAGCG-3’），可用于擴(kuò)增細(xì)菌基因組中兩個(gè)相鄰ERIC序列間的片段，由于ERIC在不同細(xì)菌基因組上重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，從而得到由一系列大小不同的DNA片段組成的指紋圖譜，用于區(qū)別不同細(xì)菌的基因組。ERIC-PCR指紋圖譜具有很高的穩(wěn)定性，不同地域和不同年代的同一菌株的指紋圖譜保持一致[7]。采用不同方法提取細(xì)菌基因組，所獲得的指紋圖譜具有良好的重復(fù)性[8]。ERIC-PCR技術(shù)具有很高的靈敏度，在混合菌液中，當(dāng)一種細(xì)菌達(dá)到總菌量的0.5%時(shí)即可被檢測出來；混合菌液的指紋圖譜為各種純菌指紋圖譜的重疊相加，同樣具有穩(wěn)定性[9]。

2 單個(gè)菌株的基因組多態(tài)性分析

ERIC-PCR指紋圖譜能夠反映出細(xì)菌整個(gè)基因組的組成，具有很強(qiáng)的鑒別細(xì)菌菌株和亞種的能力[10]。利用ERIC-PCR技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行基因組多態(tài)性分析，可用于細(xì)菌基因分型、細(xì)菌耐藥譜與基因型之間的關(guān)系研究、流行病學(xué)調(diào)查和傳染源追蹤。

Wolska等[11]采用 PCR核糖體分型和ERICPCR兩種方法對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）臨床分離株進(jìn)行基因分型，分別獲得9和36個(gè)基因型，結(jié)果提示ERIC-PCR方法比 PCR核糖體分型方法和傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法具有更強(qiáng)的區(qū)分能力。Souza等[12]運(yùn)用ERIC-PCR、脈沖場凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE）、16S rRNA和多位點(diǎn)序列分析（Multilocus Sequence Analysis, MLSA）四種分子技術(shù)對耶爾森菌進(jìn)行分類與鑒定，結(jié)果表明ERIC-PCR、16S rRNA和MLSA是耶爾森菌分類與鑒定的重要工具，而PFGE不能用于分類。相比于16S rRNA和MLSA，ERIC-PCR具有更便宜、更簡單、更快速的特點(diǎn)，被認(rèn)為是耶爾森菌傳統(tǒng)分類方法的一種替代技術(shù)。

Nath等[13]研究分離自1987～2006年間的傷寒患者的 113株傷寒沙門菌，使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD）和 ERIC-PCR兩種方法進(jìn)行基因分型。對隨機(jī)抽取的 33株傷寒沙門菌進(jìn)行分析，ERIC-PCR分辨率高于RAPD，重復(fù)率達(dá)100%，被認(rèn)為是一種更有效的分析方法。利用ERIC-PCR技術(shù)將33株細(xì)菌分成Ⅰ型和Ⅱ型兩大類型，Ⅰ型又分為四個(gè)亞型Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd。Ⅰa亞型中的菌株均對環(huán)丙沙星（CIP）敏感；Ⅰb和Ⅰc亞型中既含有CIP敏感株又含有CIP耐藥株；Ⅰd亞型中的菌株均對CIP耐藥。ERIC-PCR技術(shù)將任意抽取的89株傷寒沙門菌分成71個(gè)基因型，表明傷寒沙門菌基因組具有快速變化和變異的能力。Viana等[14]對一所醫(yī)院兩個(gè)時(shí)期（1994～1996年和2004～2007年）的150株鮑曼不動桿菌分離株進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)和ERIC-PCR基因分型，鮑曼不動桿菌分離株來源于醫(yī)院環(huán)境和住院病人。結(jié)果表明耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌由2%上升到73%；ERIC-PCR技術(shù)將鮑曼不動桿菌分為 38個(gè)基因型。研究結(jié)果表明耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的流行不是由一個(gè)基因型細(xì)菌傳播引起的，兩個(gè)時(shí)期分別分離的相同基因型菌株顯示鮑曼不動桿菌可存在于醫(yī)院環(huán)境中數(shù)年，一旦獲得另外的耐藥基因便更容易流行。

Goel等[15]應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)對2005年發(fā)生在印度的霍亂疫情進(jìn)行了研究，主要獲得兩種指紋圖譜，分別對應(yīng)兩個(gè)疫情高峰，結(jié)果表明這次霍亂疫情是由降雨帶來的兩個(gè)不同基因型霍亂弧菌引起的。Reza Ranjbar等[16]對發(fā)生在伊朗加茲溫的一起食物中毒事件進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果從水樣和部分入院治療患者的糞便標(biāo)本中分離得到霍亂弧菌，采用ERIC-PCR技術(shù)分析霍亂弧菌之間的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示引起這次霍亂暴發(fā)的霍亂弧菌源于同一克隆，而井水是傳染源。

3 微生物群落結(jié)構(gòu)的分析

微生物群落結(jié)構(gòu)中的細(xì)菌數(shù)目少則幾種到幾十種，多則幾百種。如果微生物群落結(jié)構(gòu)中的細(xì)菌種類較多，傳統(tǒng)方法便束手無策。而ERIC-PCR指紋圖譜可以反映微生物群落的種群多樣性與結(jié)構(gòu)特征，可用于微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析、觀察微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化及對不同微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異性分析。

Singh等[17]研究糖尿病足的細(xì)菌感染情況，ERIC-PCR技術(shù)可將用傳統(tǒng)方法分離得到的38株細(xì)菌分成 34個(gè)基因型，其中傳統(tǒng)方法鑒定為兩種類型的同種細(xì)菌利用ERIC-PCR技術(shù)則區(qū)分為8個(gè)基因型，因此ERIC-PCR技術(shù)相對于傳統(tǒng)分類方法是一種更敏感的檢測方法。

Yang等[18]對比分析了急性酒精性肝損傷模型組、健脾活血方干預(yù)組、健康對照組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的ERIC-PCR指紋圖譜，從分子水平觀察了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的組間差異和個(gè)體差異。聚類分析顯示模型組大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，而健脾活血方能調(diào)節(jié)腸道菌群，能在一定程度上恢復(fù)大鼠腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)語

相對于細(xì)菌分類的傳統(tǒng)方法和其它分子生物學(xué)技術(shù)，ERIC-PCR是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分子生物學(xué)方法。ERIC-PCR技術(shù)能夠有效區(qū)分細(xì)菌菌株間的差異性，特別是在流行病學(xué)調(diào)查和傳染源追蹤方面具有重要價(jià)值。腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化常與疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，ERIC-PCR指紋圖譜能夠精確反映出這種變化，從而成為研究腸道菌群結(jié)構(gòu)的有力工具?？傊?，ERIC-PCR技術(shù)在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。

[1]艾對元. 基因組中重復(fù)序列的意義[J]. 生命的化學(xué),2008, 28(3): 343-345.

[2]SHARPLES G J, LLOYD R G. A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes [J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18(22):6503-6508.

[3]HULTON C S J, HIGGINS C F, SHARP P M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of escherichia coli,salmonella typhimurium and other enterobacteria [J]. Mol Microbiol, 1991, 5(4):825-834.

[4]BACHELLIER S, CLEMENT J M. Short palindromic repetitive DNA elements in enterobact eria: a surver [J].Res Microbiol, 1999, 150(9/10): 627-639.

[5]林朝洪, 倪學(xué)勤, 曾東, 等. 重復(fù)序列ERIC(IRU)研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2007, 47(2): 370-373.

[6]VERSALOVIC J, KOEUTH T, LUPSKI JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and applicafion to finger printing of bacterial genomes [J].Nucleic Acids Res, 1991, 19(24): 6823-6831.

[7]DALLA-COSTA LM, ITINOK, RODRIGUES J, et a1.Characterisation of diarrhoeagenic escherichia coil clones by ribotyping and ERIC-PCR [J]. J Med Microbiol, 1998, 47(3): 227-234.

[8]Houf K, dezutterl, Van Hoof J, et al. Assessment of the genetic diversity among arcobacters isolated from poultry products by using two PCR-based typing methods[J]. Appl Envimn Microbiol, 2002, 68(5):2172-2178.

[9]李艷琴, 孫永艷, 崔麗方, 等. ERIC–PCR在人工混合菌體系中的檢出靈敏度[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31(4):61-64.

[10]趙立平, 肖虹, 李艷琴, 等. ERIC-PCR: 一種快速鑒別環(huán)境細(xì)菌菌株的方法[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),1999, 5(增刊): 30-33.

[11]WOLSKA K, SZWEDA P. A comparative evaluation of PCR ribotyping and ERIC PCR for determining the diversity of clinical pseudomonas aeruginosa isolates[J].Pol J Microbiol, 2008, 57(2): 157-163.

[12]SOUZA RA, PITONDO-SILVA A, FALCAO DP, et al.Evaluation of four molecular typing methodologies as tools for determining taxonomy relations and for identifying species among yersinia isolates[J]. J Microbiol Methods, 2010, 82(2): 141-150.

[13]NATH G, MAURYA P, GULATI AK. ERIC PCR and RAPD based fingerprinting of salmonella typhi strains isolated over a period of two decades [J]. Infect Genet Evol, 2010, 10(4): 530-536.

[14]VIANA GF, DOS SANTOS SAALFELD SM, GARCIA LB, et al. Evolution of antimicrobial resistance of acinetobacter baumannii in a university hospital [J].Lett Appl Microbiol, 2011, 53(3): 374-378.

[15]GOEL A K, JIANG S C. Association of heavy rainfall on genotypic diversity in v. cholerae isolates from an outbreak in india [J]. Int J Microbiol, 2011, 2011:230597. Published online.

[16]RANJBAR R, RAHBAR M, NAGHONI A, et al. A cholera outbreak associated with drinking contaminated well water [J]. Arch Iran Med, 2011, 14(5): 339-340.

[17]SINGH S K, GUPTA K, TIWARI S, et al. Detecting aerobic bacterial diversity in patients with diabetic foot wounds using eric-pcr: a preliminary communication[J]. Int J Low Extrem Wounds, 2009, 8(4): 203-208.

[18]CHENG Y, WANG HH, HU YY, et al. Structural shifts of gut flora in rat acute alcoholic liver injury and jianpi huoxue decoction's effect displayed by eric-pcr fingerprint[J]. Chin J Integr Med, 2011, 17(5): 361-368.