慢性應(yīng)激對大鼠凝血功能和血小板活化的影響及電針的干預(yù)作用

宋洪濤，武忠，張瑞霞，賽音朝克圖，景泉凱，姚海江

慢性應(yīng)激對大鼠凝血功能和血小板活化的影響及電針的干預(yù)作用

宋洪濤1，武忠1，張瑞霞1，賽音朝克圖2，景泉凱3，姚海江4,5

目的觀察慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠血漿凝血功能變化以及電針的干預(yù)作用。方法雄性Sprague-Dawley大鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白組、模型組、氟西汀組、電針組，每組8只。后三組采用慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)21 d建立大鼠抑郁模型，氟西汀組、電針組分別同時采用氟西汀、電針進(jìn)行干預(yù)。測定各組大鼠凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)；酶聯(lián)免疫吸附測定檢測大鼠6酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、P-選擇素、血栓烷素B2(TXB2)的變化。結(jié)果模型組曠場試驗水平運動次數(shù)和垂直運動次數(shù)較空白組明顯降低(P<0.01)，電針組和氟西汀組較模型組明顯增加(P<0.01)。與空白組比較，模型組PT、APTT、TT明顯縮短(P<0.01)，F(xiàn)IB含量升高(P<0.05)；血清6-keto-PGF1α含量降低(P< 0.05)，P-選擇素、TXB2含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組、電針組PT、APTT、TT延長(P<0.05)，血清6-keto-PGF1α含量升高(P<0.01)，P-選擇素、TXB2含量降低(P<0.05)，電針組FIB含量降低(P<0.05)。結(jié)論慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠凝血功能增強(qiáng)，血小板活化功能異常，電針和氟西汀可改善這些變化。

抑郁；電針；凝血功能；血小板活化；大鼠

[本文著錄格式]宋洪濤，武忠，張瑞霞，等.慢性應(yīng)激對大鼠凝血功能和血小板活化的影響及電針的干預(yù)作用[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(3):304-307.

CITED AS:Song HT,Wu Z,Zhang RX,et al.Alteration of coagulation function and platelet activation in chronicity stress depression model rats and effect of electroacupuncture[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):304-307.

心理因素在身體健康中發(fā)揮重要作用。近年來人們逐漸認(rèn)識到，作為一種情感障礙類疾病，抑郁癥影響著心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[1]。抑郁癥患者血小板活性增強(qiáng)，而血小板凝聚功能異常與心血管疾病密切相關(guān)，推測血小板功能異常在抑郁與心血管疾病之間發(fā)揮重要作用[2]。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體質(zhì)量(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，使用許可證號SCXK(京)2016-0001。大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，自然晝夜光照環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。行曠場試驗(open field test)，剔除行為靜止和過于活躍的大鼠，再采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成空白組、模型組、氟西汀組和電針組，每組8只。

1.2主要儀器與試劑

LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀：北京世帝科學(xué)儀器公司。V2.3酶標(biāo)儀：MULTISKAN EX PRIMARY EIA。凝血酶原時間(prothrombin time, PT)試劑盒(批號20160407)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)試劑盒(批號20160413)、凝血酶時間(thrombin time,TT)試劑盒(批號20160422)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)試劑盒(批號20160402)：南京建成生物科技有限公司。大鼠6酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號abx051885)：ABBEXA公司。大鼠P-選擇素ELISA試劑盒(貨號ELR-Pselectin-1)：RAYBIOTECH公司。大鼠血栓烷素B2(thromboxane B2,TXB2)ELISA試劑盒(貨號ADI-900-002)：ENZO公司。鹽酸氟西汀膠囊：禮來蘇州制藥有限公司。LH202型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀：北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.3模型制備[3-4]

共用7種應(yīng)激因子：①斷食24 h；②斷水24 h；③潮濕墊料24 h；④晝夜顛倒24 h；⑤4℃冷水游泳5 min；⑥距尾尖2 cm處夾尾3 min；⑦30 V電擊足底5 s。每天隨機(jī)給予1種刺激因子進(jìn)行應(yīng)激，平均每種刺激3次。大鼠單獨飼養(yǎng)于鐵籠內(nèi)(孤養(yǎng))。共21 d。

1.4處理方法

空白組：群養(yǎng)，不造模及干預(yù)。模型組：單純造模。氟西汀組：造模同時灌胃給藥，鹽酸氟西汀以生理鹽水配成1 mg/ml，每天2 mg/kg。電針組：孤養(yǎng)，應(yīng)激刺激前1 h電針百會和印堂，頻率2 Hz，電流1 mA，每次20 min。共干預(yù)21 d。

1.5曠場試驗

分別于實驗前1 d以及實驗第22天行曠場試驗。箱體規(guī)格為80×80×40 cm，箱底及四壁涂成黑色，用白線將底面橫縱各分5等分，形成25個16×16 cm的正方形。提拉大鼠尾端，將大鼠置于中心方格固定位置，待大鼠情緒穩(wěn)定后放開大鼠，人在距離大鼠1 m外觀察大鼠3 min內(nèi)的水平運動次數(shù)(大鼠穿越箱底方格的次數(shù))和垂直運動次數(shù)(大鼠直立或攀墻的次數(shù))。

檢測前后均徹底清洗箱內(nèi)，保證每只動物不受前只大鼠的影響。

1.6樣品制備和檢測方法

1.6.1PT、APTT、TT、FIB檢測

行為學(xué)檢測結(jié)束后，大鼠斷頭取血2 ml，置于含1∶9檸檬酸鈉溶液0.2 m1的測定管中，輕輕顛倒混合10次。4℃、3000 r/min離心15 min，-20℃保存待測。利用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析儀檢測大鼠PT、APTT、TT和FIB。

1.6.26-keto-PGF1α、P-選擇素、TXB2檢測

行為學(xué)檢測結(jié)束后，大鼠斷頭取血2 ml，4℃、3000 r/min離心15 min，-20℃保存待測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測6-keto-PGF1α、P-選擇素、TXB2。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗結(jié)果以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1曠場試驗

實驗前，各組大鼠水平運動及垂直運動水平無顯著性差異(P>0.05)。應(yīng)激刺激后，模型組水平及垂直運動次數(shù)較空白組明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，氟西汀組水平及垂直運動次數(shù)明顯升高(P< 0.01)，電針組水平及垂直運動次數(shù)也明顯升高(P< 0.01)。見表1。

2.2PT、APTT、TT、FIB

與空白組比較，模型組大鼠血漿PT、APTT、TT時間明顯縮短(P<0.01)，F(xiàn)IB含量升高(P<0.05)；與模型組比較，氟西汀組PT、APTT、TT時間延長(P< 0.05)，F(xiàn)IB含量無顯著性差異(P>0.05)，電針組PT、APTT、TT時間延長(P<0.05)，F(xiàn)IB含量降低(P< 0.05)。見表2。

2.36-keto-PGF1α、P-選擇素、TXB2

與空白組比較，模型組血清6-keto-PGF1α含量降低(P<0.05)，P-選擇素及TXB2含量明顯升高(P< 0.01)；與模型組比較，氟西汀組6-keto-PGF1α含量明顯升高(P<0.01)、P-選擇素及TXB2含量下降(P< 0.05)，電針組6-keto-PGF1α含量有上升趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)，P-選擇素及TXB2含量明顯下降(P<0.01)。見表3。

3 討論

抑郁癥患者多伴有5-羥色胺系統(tǒng)功能異常，血小板活性和凝聚力均高于非抑郁癥者[5]。血小板活化功能異常與心血管疾病密切相關(guān)[6]，多項研究也表明，抑郁癥患者較正常人群的血小板活性[7]、P-選擇素的反應(yīng)性[8-9]增強(qiáng)?？挂钟羲幙山档突颊哐“寰奂潭萚10]、抑制血小板活性[11]。因此，有學(xué)者認(rèn)為抑郁癥和心血管疾病存在著共同的病理生理改變，即血小板活性增強(qiáng)[12]。

表1 各組大鼠曠場試驗水平運動及垂直運動情況比較

表2 各組大鼠血PT、APTT、TT、FIB比較

表3 各組大鼠血6-keto-PGF1α、P-選擇素、TXB2比較

PT、APTT、TT、FIB是檢測凝血功能最常用的指標(biāo)。其中PT、APTT分別是外源性凝血因子、內(nèi)源性凝血因子的篩查試驗，F(xiàn)IB是凝血過程中的主要蛋白質(zhì)，TT檢查血漿內(nèi)纖維蛋白原水平及血漿中肝素樣物質(zhì)的多少，當(dāng)FIB水平增多時，TT縮短[13-14]。

TXA2是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)與血小板聚集劑之一，可以激活血小板，使其聚集。PGI2是較強(qiáng)的血小板聚集抑制劑，具有抑制血小板促凝活性作用。TXA2與PGI2的動態(tài)平衡影響血小板聚集功能和血管舒縮功能。由于TXA2和PGI2性質(zhì)不穩(wěn)定，我們通過檢查它們的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α來判斷其水平。P-選擇素是血小板活化后期的標(biāo)志物，參與血小板黏附與聚集過程，可作為血小板活化的特異性標(biāo)志[15-16]。

本研究顯示，慢性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)21 d后，大鼠探究行為和運動能力降低，表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)，模型復(fù)制成功。抗抑郁藥及電針干預(yù)均有改善抑郁的作用。

抑郁模型大鼠PT、APTT、TT時間縮短，F(xiàn)IB含量升高，提示凝血功能紊亂；抗抑郁藥物及電針治療可抑制凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而間接抑制纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)變。

抑郁大鼠TXB2含量升高，6-keto-PGF1α含量降低，P-選擇素含量升高，提示血小板活化異常；抗抑郁藥物及電針均可以改善抑郁大鼠的血小板功能。

目前臨床抗抑郁藥物主要為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)和5-羥色胺/去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin& norepinephrine reuptake inhibitor,SNRI)兩類。SSRI類藥物會出現(xiàn)焦慮、失眠、性欲減退、惡心等不適癥狀[17]，SNRI類藥物會出現(xiàn)惡心、頭痛、頭暈、嗜睡、虛弱、食欲減退，甚至5-羥色胺綜合征等不良反應(yīng)[18]。針刺通過多層次、多靶向?qū)C(jī)體進(jìn)行綜合調(diào)節(jié)[19]。研究表明，針刺與氟西汀治療抑郁癥療效相當(dāng)，但不良反應(yīng)輕微短暫[20-21]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，抑郁癥是髓海虧虛、神機(jī)紊亂失調(diào)所致，病位在腦。督脈循行過腦，為全身陽脈之海，具有總領(lǐng)陽氣、通脈醒神的作用[22]。本研究選取臨床使用頻率最高的百會、印堂兩穴，其抗抑郁作用在臨床和基礎(chǔ)實驗中均已證實[23-25]。本研究顯示，電針印堂、百會在改善抑郁的同時，也對抑郁大鼠的凝血功能及血小板功能異常有改善作用，這可能與其發(fā)揮抗抑郁作用有關(guān)。

我們認(rèn)為，機(jī)體在抑郁狀態(tài)下，存在血小板活化途徑過度激活，進(jìn)而影響心血管事件的發(fā)生。電針可以改善抑郁狀態(tài)及血小板功能異常，安全有效，值得在臨床推廣。其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Alteration of Coagulation Function and Platelet Activation in Chronicity Stress Depression Model Rats and Effect of Electroacupuncture

SONG Hong-tao1,WU Zhong1,ZHANG Rui-xia1,SAIYIN Chao-ketu2,JING Quan-kai3,YAO Hai-jiang4,5
1.Inner Mongolia People's Hospital,Hohhot,Inner Mongolia 010010,China;2.Inner Mongolia International Mongolian Hospital,Hohhot,Inner Mongolia 010065,China;3.School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;4.Treatment Center of Traditional Chinese Medicine,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;5.Capital Medical University School of Rehabilitation,Beijing 100068,China

SONG Hong-tao.E-mail:renxuxing@126.com

ObjectiveTo observe the change of coagulation function in chronic stress depression model rats and the effects of electroacupuncture(EA)on it.MethodsA total of 32 Sprague-Dawley rats were randomly divided in control group(n=8),model group(n=8), EA group(n=8)and fluoxetine group(n=8)after a week of acclimation.The 21-day unpredictable mild stress combined with solitarily feeding was used to make the depression model in the latter three groups,meanwhile EA group and the fluoxetine group accepted EA and fluoxetine.They were measured the prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thrombin time(TT)and fibrinogen (FIB).Serum levels of 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α),P-selectin,thromboxane B2(TXB2)were determined with enzyme-linked immunoabsorbent assay.ResultsThe cross and rear scores were significantly lower in the model group than in the control group(P<0.01).The scores increased in EA group and the fluoxetine group(P<0.01)compared with the model group.Compared with the control group,PT, APTT and TT decreased(P<0.01),FIB increased(P<0.05),the level of 6-keto-PGF1αdecreased,the level of P-selectin and TXB2increased (P<0.01)in the model group.Compared with the model group,PT,APTT and TT increased(P<0.05),the level of 6-keto-PGF1αincreased (P<0.01),and the level of P-selectin and TXB2decreased(P<0.05)in EA group and the fluoxetine group,and FIB decreased in EA group (P<0.05).ConclusionThe chronic stress depression rats are impaired in the coagulation function and platelet activation,and can be allayed with electroacupuncture and fluoxetine.

depression;electroacupuncture;coagulation function;platelet activation;rats

[中圖分類號]R749.7

A

1006-9771(2017)03-0304-04

2016-10-12

2016-12-23)

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)基金項目(No.201557)。

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特市010010；2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特市010065；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京市100029；4.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院中醫(yī)治療中心，北京市100068；5.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068。作者簡介：宋洪濤(1982-)，男，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：針刺干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的機(jī)理研究。E-mail:renxuxing@126.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.011