白細(xì)胞介素18及其在禽類中的研究進(jìn)展

李 行，韓凌霞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，黑龍江哈爾濱 150001）

白細(xì)胞介素18（Interleukin-18，IL-18）主要由單核-巨噬細(xì)胞系分泌，在結(jié)構(gòu)上屬于IL-1家族[1]，在功能上與IL-12相似，而且與IL-12有協(xié)同效應(yīng)，是重要的調(diào)節(jié)先天性免疫和獲得性免疫的因子。IL-18除了能夠明顯誘導(dǎo)Th1、NK及 NKT細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ外，還可誘導(dǎo)諸如IL-2、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）及腫瘤壞死因子（TNF-α）等其它多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生[2]。禽IL-18具有與人和哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)功能，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫等中具有應(yīng)用潛力。

1 IL-18的發(fā)現(xiàn)

1995年Okamura在被熱滅活痊瘡丙酸桿菌感染和脂多糖（LPS）誘發(fā)的中毒性休克小鼠肝臟提取液中獲得一種蛋白，功能與IL-12非常相似，但誘生IFN-γ的能力要強(qiáng)于 IL-12，因而最初被稱為 IFN-γ誘生因子（Interferon gamma inducing factor，IGIF）[3]。但I(xiàn)GIF的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中任何己知蛋白均不同，并具有多種生物學(xué)功能。1996年Ushio等從人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選到IGIF基因，將其正式命名為IL-18[4]。2000年Schneider等根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的基因序列，首次從LPS刺激的雞巨噬細(xì)胞系HD-11的總RNA中擴(kuò)增到雞IL-18基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)雛雞脾細(xì)胞IFN-γ的合成，證明了雞IL-18具有生物學(xué)活性[5]。隨后國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了對(duì)禽IL-18的體外擴(kuò)增[6]。2010年Honga制備了雞IL-18的單克隆抗體（MAb）[7]。Kaiser報(bào)道獲得火雞IL-18基因[8]。水禽中目前已得到北京鴨（WP）、北京鴨M 2雜系（WM）、固始鴨[9]、麻鴨[10]、廣東水鴨[11]、櫻桃谷鴨[12]以及鵝[13]的IL-18核苷酸序列。

2 IL-18的組織分布及分子結(jié)構(gòu)

2.1 IL-18的組織分布 在早期的炎癥反應(yīng)應(yīng)答中，造血和非造血譜系的細(xì)胞都可以檢測(cè)到IL-18。目前報(bào)道在多種器官、組織和細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-18 mRNA，如胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、活化的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞[14-15]。

2.2 IL-18的分子結(jié)構(gòu) 人的IL-18基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)約19.5 kb。小鼠的IL-18基因位于9號(hào)染色體，由7個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)約26 kb。雞IL-18 cDNA全長(zhǎng)為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸殘基組成的前體多肽，其中29個(gè)氨基酸殘基組成的引導(dǎo)序列，缺乏經(jīng)典的N-糖基化位點(diǎn)和疏水信號(hào)肽。保守的第29位天冬酰胺殘基，是半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）的識(shí)別位點(diǎn)，可以發(fā)生切割除去前導(dǎo)序列成為成熟的雞IL-18多肽。火雞IL-18的編碼區(qū)和雞的同源性很高，核苷酸為96.1%，氨基酸為97.4%?；痣u的3'端非編碼區(qū)包括兩個(gè)不穩(wěn)定單元ATTTA，能調(diào)節(jié)mRNA快速降解，以及一個(gè)完整的poly A位點(diǎn)AATAAA。而雞在同一區(qū)域只有一個(gè)不穩(wěn)定因子并且缺乏完整的poly A位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明火雞和雞的IL-18與哺乳動(dòng)物分成兩個(gè)不同的組，推測(cè)雞和火雞IL-18在生物學(xué)活性方面可能存在交叉反應(yīng)。鴨與雞和火雞的核苷酸同源性分別為86.9%和87.1%，而氨基酸同源性分別為96.5%和97.0%，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，鴨IL-18基因與雞和火雞進(jìn)化關(guān)系較近。與雞、火雞、鴨IL-18序列相比，鵝與鴨基因序列相似性最高，達(dá)99%[8]。

3 IL-18的受體

IL-18受體（IL-18R）由 α 鏈（IL-18Rα）和 β 鏈（IL-18Rβ）構(gòu)成，其中α鏈為受體的親和亞基，β鏈為信號(hào)傳導(dǎo)亞基，兩者均屬于免疫球蛋白樣（Ig）超家族成員和IL-1受體家族成員[16-17]。研究表明IL-18R只在極化的Th1細(xì)胞上高水平表達(dá)，而在Th2細(xì)胞上不表達(dá)。因此，IL-18R可以作為區(qū)分Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的有效表面標(biāo)志。小鼠體內(nèi)很多組織均可以檢測(cè)到IL-18Rα的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括胸腺、脾、肝、肺、小腸、結(jié)腸、胎盤、前列腺和心臟等，在卵巢和睪丸中有微量表達(dá)，但在大腦、腎、骨骼肌和胰腺中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

當(dāng)IL-18與IL-18Rα結(jié)合形成復(fù)合物后，IL-18Rβ被募集到該復(fù)合物中，但在IL-18與IL-18Rα結(jié)合之前IL-18Rβ并不與IL-18相互作用。IL-18和IL-18Rα結(jié)合的親和力較低，但與IL-18Rβ形成三聚體復(fù)合物以后，親和力顯著提高。三聚體復(fù)合物形成以后，IL-18R募集細(xì)胞質(zhì)中髓樣細(xì)胞分化蛋白（MyD88），MyD88有許多胞質(zhì)受體功能域的特征，在信號(hào)傳導(dǎo)中起接頭或者是錨定分子的作用，可以活化下游信號(hào)，特別是白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）的活化，能夠與下游基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）6相互作用，激活抑制性κB激酶（IKK），引起IκB的降解和NF-κB的活化，產(chǎn)生一系列生物學(xué)活性[18-19]。禽IL-18受體的研究目前報(bào)道不多，但雞IL-18Rα的mRNA序列已經(jīng)公布。

4 IL-18的天然拮抗物IL-18結(jié)合蛋白

IL-18結(jié)合蛋白（IL-18 binding protein，IL-18BP）是在研究人尿胞外可溶性受體時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的，屬于Ig超家族成員，人IL-18BP（hIL-18BP）有3種剪接變異體。IL-18BP與IL-18的親合力可高達(dá)400 pmol/L。IL-18BP與IL-18R的氨基酸同源性很低，IL-18BP缺少跨膜區(qū)域，僅含有一個(gè)Ig樣區(qū)域[20-21]。IL-18BP與IL-1Ⅱ類受體有許多相似特征。IL-18BP在脾臟和腸道中高度表達(dá)。IL-18BP的啟動(dòng)子含有兩個(gè)IFN-γ應(yīng)答元件，其組成型表達(dá)是IFN-γ依賴性的[20]。人和小鼠痘病毒編碼的一些蛋白，如MC53L和MC54L，其基因編碼序列與IL-18BP蛋白高度同源，與人和小鼠的IL-18具有良好的親合性，能抑制IL-18誘導(dǎo)IFN-γ的活性，可能是痘病毒免疫逃避的機(jī)制之一[22]。小鼠痘病毒、人痘苗病毒、接觸性軟疣病毒和羊痘病毒均含有IL-18BP的基因組編碼基因，其它痘病毒，如猴痘病毒、豬痘病毒和禽痘病毒（FPV）可能含有同源物[23]。2010年劉文強(qiáng)等從FPV的基因組分離到雞IL-18BP基因，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的表達(dá)蛋白具有拮抗IL-18刺激外周血單核細(xì)胞（PBMC）和MSB1細(xì)胞（雞馬立克氏病毒轉(zhuǎn)化雞外周血淋巴細(xì)胞系）分泌IFN-γ的活性[24]。

5 IL-18的生物學(xué)功能

IL-18在先天免疫及后天免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中都起重要作用，在慢性炎癥、自身免疫性病、各種各樣的癌變及眾多傳染病的發(fā)生過(guò)程中檢測(cè)到IL-18的表達(dá)[25]。

5.1 IL-18對(duì)T淋巴細(xì)胞的作用 IL-18介導(dǎo)Th1型細(xì)胞反應(yīng)，刺激IFN-γ的產(chǎn)生，對(duì)T淋巴細(xì)胞的作用包括：（1）影響T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子：小鼠IL-18作用于抗CD3單抗刺激 T細(xì)胞后能促進(jìn) T細(xì)胞增殖和 IFN-γ、GM-CSF、IL-2的產(chǎn)生，而對(duì)IL-4和IL-10無(wú)誘導(dǎo)作用，表明IL-18可能選擇性地對(duì)Thl細(xì)胞發(fā)生作用。IL-18表現(xiàn)出強(qiáng)于IL-12的誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的能力，聯(lián)合使用能更有效地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。（2）影響T細(xì)胞的增殖：IL-18可明顯刺激CD3 MAb活化的人T細(xì)胞增殖，并且增殖效應(yīng)表現(xiàn)出劑量依賴性，而雞IL-18不需要IL-2的共刺激，便可以刺激雞脾臟中T細(xì)胞增殖。（3）調(diào)控T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答：IL-18在調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)TCR/CD3介導(dǎo)的應(yīng)答過(guò)程中起著重要的作用，另外在次級(jí)免疫應(yīng)答中，通過(guò)誘生IFN-γ使T細(xì)胞前體向Thl細(xì)胞分化并促進(jìn)其分泌IL-18，參與Th1/Th2細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)。IL-18不能誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，但可能通過(guò)促進(jìn)IL-12誘導(dǎo)向Th1細(xì)胞分化。當(dāng)然，IL-18的過(guò)量表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體紊亂[26-27]。

5.2 IL-18對(duì)B細(xì)胞的作用 Hoshino等發(fā)現(xiàn)IL-18轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)目減少，但I(xiàn)gE、IgG等含量卻高于正常水平，當(dāng)用IL-18與IL-12同時(shí)刺激時(shí)可以明顯抑制Ig的分泌，促使CD40抗體活化的B細(xì)胞分泌IFN-γ，產(chǎn)生的IFN-γ抑制IgE、IgG1的生成，同時(shí)提高IgG2a的表達(dá)量，提示IL-18可能通過(guò)上調(diào)B細(xì)胞表面的IL-18Rβ的含量阻斷由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)[28]。

5.3 IL-18對(duì)NK細(xì)胞活性的影響 IL-18與NK細(xì)胞發(fā)揮功能有關(guān)。IL-18缺失或IL-18Rα缺陷的小鼠與野生型小鼠有相同數(shù)目的NK細(xì)胞，但表現(xiàn)出較弱的溶靶細(xì)胞作用。IL-18可以上調(diào)NK及CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[29]。

5.4 IL-18的應(yīng)用前景 IL-18通過(guò)多種機(jī)制對(duì)多種腫瘤具有抗腫瘤效應(yīng)，如纖維肉瘤、黑色素瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤和膠質(zhì)瘤等。Fas-FasL系統(tǒng)是機(jī)體清除無(wú)用的免疫細(xì)胞維持免疫系統(tǒng)自身穩(wěn)定的重要因素，IL-18促進(jìn)FasL在Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)Fas-FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體殺傷腫瘤及病毒感染細(xì)胞的作用。雞IL-18在雞腫瘤病馬立克氏病的病程中也起重要的作用[30]。

在抵抗感染性疾病方面，Kawakami等在用新型隱球菌細(xì)胞株使肺彌漫性感染時(shí)，表達(dá)的重組小鼠IL-18蛋白提高了病菌從肺的排出，并防止其向腦部擴(kuò)散，提高了鼠的存活率[31-32]。利用IL-18治療，可以使腦心肌炎病毒（EMCV）感染小鼠產(chǎn)生抗病毒能力，提高被I型單純皰疹病毒（HSV-1）感染小鼠的存活率。將利什曼原蟲感染IL-18缺陷小鼠，能引起比對(duì)照組嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化，而且易感性顯著提高，IFN-γ的表達(dá)量下降，IL-4的分泌量卻顯著提高，抑制一氧化氮合成酶的表達(dá)，從而降低機(jī)體對(duì)利什曼原蟲感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)[33]。

6 小結(jié)

IL-18具有促IFN-γ產(chǎn)生的生物學(xué)活性。多種病毒可在體外和體內(nèi)刺激產(chǎn)生具有生物活性的IL-18，決定在早期免疫中起主要作用的IFN-γ的分泌。禽IFN-γ具有增強(qiáng)機(jī)體二次免疫應(yīng)答、提高機(jī)體抵抗力和促進(jìn)生長(zhǎng)等作用，是一種有效的免疫佐劑和治療型制劑。目前，多種鴨病毒性疾病如鴨瘟等已給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而應(yīng)用傳統(tǒng)疫苗免疫存在諸如應(yīng)激反應(yīng)大，或免疫原性較低而保護(hù)率不高等問(wèn)題，已有學(xué)者研究鴨Il-18在疫苗中的分子佐劑作用，并已得到了證明[11]?？傊?，IL-18有望成為疫苗的一種重要的細(xì)胞免疫佐劑，在提高機(jī)體抗感染力、增強(qiáng)滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Kaiser P.The avian immune genome-a glass half-full or halfempty[J].Immunology,2007,117（1）:221-230.

[2]W ittmann M,Macdonald A,Renne J.IL-18 and skin inflammation production[J].Autoimmunity Reviews,2009,9（1）:45-48.

[3]Okamura H,Tsutsui H,Komatsu T,et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T-cells[J].Nature,1995,378:88-91.

[4]Ushio S,Namba M,Okura T,et al.cDNA cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor,expression inEscherichia coliand studies on the biologic activities of the protein[J].J Immunol,1996,156:4274-4279.

[5]Ma Ming-xiao,Jin Ning-yi,Wang Zhen-guo,et al.Construction and immunogenicity of recombinant fow lpox vaccines coexpressing HA of AIV H5N1 and chicken IL18[J].Vaccine,2006,24（20）:4304-4311.

[6]胡敬東，崔治中，范偉興，等.雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白全長(zhǎng)基因的克隆與序列測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（2）：119-121.

[7]Hong Y H,Lillehoj H S,Lee SH,et al.Development and characterization ofmouse monoclonal antibodies specific for chicken interleukin 18[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,138:144-148.

[8]Kaiser P.Turkey and chicken interleukin-18（IL18）share high sequence identity,but have different polyadenylation sites in their 3'-UTR[J].Dev Comp Immunol,2002,26（8）:681-687.

[9]Chen Hong-ying,Cui Bao-an,Xia Pin-an,et al.Cloning,in vitro expression and bioactivity of duck interleukin-18[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,123:205-214.

[10]陳紅英，崔保安，夏平安，等.麻鴨IL-18成熟蛋白基因的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性檢測(cè)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（4）：584-588.

[11]韓先干，黃青云，尹會(huì)方，等.鴨IL-18基因克隆與序列分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3545-3547.

[12]龔朋飛，周慶豐，蘇潤(rùn)環(huán)，等.櫻桃谷鴨白介素18基因的克隆與原核表達(dá)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34（2）：28-30.

[13]鄭海華，韓先干，尹會(huì)方，等.鵝IL-18基因的克隆和原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（03）：274-278.

[14]潘蔚綺，李廣興，劉勝旺.白細(xì)胞介素18和雞白細(xì)胞介素18[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（1）：123-128.

[15]Dinarello C A.Interleukin 1 and interleukin 18 as mediators of inflammation and the aging process[J].Am JClin Nutr,2006,83（2）:447S-455S.

[16]Azam T,Novick D,Bufler P,et al.Identification of a critical Ig-like domain in IL-18 receptor alpha and characterization of a functional IL-18 receptor complex[J].J Immunol,2003,171（65）:74-80.

[17]Lamkanfi M,Dixit V M.Inflammasomes:guardians of cytosolic sanctity[J].Immuno logical Reviews,2009,227（1）:95-105.

[18]VanderBrink B A,Asanuma H,Hile K,et al.Interleukin-18 Stimulate a positive feedback loop during renal obstruction via interleukin-18 receptor[J].JUrol,2011,186（4）:1502-1508.

[19]Leach S T,Messina I,Lemberg D A,et al.Local and system ic interleukin-18 and interleukin-18-binding protein in children w ith inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis,2008,14（1）:68-74.

[20]Kim SH,Azam T,Novick D,et al.Identification of am ino acid residues critical for biological activity in human interleukin-18[J].JBiol Chem,2002,277（13）:10998-11003.

[21]Dinarello C A,Interleukin-18 and the pathogenesis of inflammatory diseases[J].Seminars Nephrol,2007,27（1）:98-114.

[22]Li Jian-M ing,Eslam i MH,Rohrer MJ,et al.Interleukin 18 binding protein（IL18-BP）inhibits neointimal hyperplasia after balloon injury in an atherosclerotic rabbitmodel[J].JVascular Surgery,2008,47（5）:1048-1057.

[23]Afonso C L,Tulman E R,Lu Z,et al.The Genome of Fow lpox Virus JVirol[J].74（8）:3815-3831.

[24]劉文強(qiáng)，劉桂芹，秦緒嶺，等．重組IL-18BP拮抗重組雞IL-18刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的作用 [J]．微生物學(xué)報(bào)，2010，50（4）:506-511.

[25]Felderhoff-Mueser U,Schm idt O I,Oberholzer A.IL-18:a key player in neuroinflammation and neurodegeneration[J].Trends Neurosci,2005,28（9）:487-93.

[26]Marleau A M,Sarvetnick N E.IL-18 is required for self-reactive T cell expansion in NOD Mice[J].J Autoimm,2011,36（3）:263-277.

[27]Bryson K J,Wei Xiao-Qing,Alexander J.Interleukin-18 enhances a Th2 biased response and susceptibility to Leishmaniamexicana in BALB/cmice[J].M icrob Infect,2008,10（7）:834-839.

[28]Hoshino K,Kashiwamura S,Kuribayashi K,et al.The absence of interleukin 1 receptor-related T1:ST2 does not affect T helper cell type 2 developments and its effector function[J].J Exp Med,1999,190:1541-1547

[29]Huang Yong,Lei Ying-feng,Zhang Hai,et al.Role of interleukin-18 in human natural killer cell is associated w ith interleukin-2[J].Mol Immunol,2010,47（16）:2604-2610.

[30]Abdul-Careem MF,Hunter B D,Parvizi P,et al.Cytokine gene expression patterns associated with immunization against Marek's disease in chickens[J].Vaccine,2007,25（3）:424-432.

[31]Dlnarello C A.Interleukin-18 and the pathgenesis of inflammatory diseases[J].Sem inars Nephrol,2007,7（1）:98-114.

[32]Thompson S R,Humphries S E.Interleukin-18 genetics and inflammatory disease susceptibility[J].Genes Imm,2007,8:91-99.

[33]Bryson K J.Interleukin-18 enhances a Th2 biased response and susceptibility to Leishmania mexicana in BALB/c Mice[J].M icrob Infect,2008,10（7）:834-839.