豬博卡病毒的研究進展

郝 飛，湯德元*，羅險峰，李春燕，曾智勇，甘振磊，王 鳳, 劉 建

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴陽 550008)）

豬博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV )是一種新型的細小病毒，屬于細小病毒科細小病毒亞科博卡病毒屬。豬感染該病毒后主要癥狀為腹瀉，并集中在產(chǎn)房哺乳仔豬，哺乳仔豬死亡率達70%以上，抗生素治療和腹瀉性疫苗免疫均不能獲得效果。目前博卡病毒屬成員有牛細小病毒、人博卡病毒（1～4型）、犬微小病毒、豬博卡病毒、大猩猩博卡病毒以及黑猩猩博卡病毒。2009年瑞典科學家首次發(fā)現(xiàn)第1例豬博卡病毒（PBo-Like virus），此后在中國境內(nèi)上海市、浙江省、湖北省、江蘇省以及貴州省等地相繼發(fā)現(xiàn)并分離到豬博卡病毒。

1 病毒的發(fā)現(xiàn)

2009年，瑞典研究人員Blomstr?m等采集病死豬的淋巴結(jié)進行研磨，經(jīng)一系列處理后提取DNA，采用隨機多重置換擴增法（MDA）和高通量測序技術(shù)進行DNA擴增，最終將獲得的所有片段進行克隆、測序，進行生物信息學分析，拼接出一條1879 bp的新型細小病毒片段，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)擴增出的片段與人博卡病毒較為相似，且其主要是NP蛋白和部分VP1蛋白的編碼序列，故暫將其命名為豬類博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）[1]。隨后翟少倫等[2]參照Blomstr?m等人獲得的豬類博卡病毒的序列設(shè)計引物，于2010年首次在中國檢測出了豬博卡病毒。研究表明[3]，豬博卡病毒流行確實存在，并且全基因組相近于博卡病毒屬，故將其劃為細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬。

2 病毒的分子特征

PBoV是一種單鏈無包膜的DNA病毒，體積小，結(jié)構(gòu)簡單，為正20面體顆粒，直徑約為25～30 nm?；蚪M為單鏈線性DNA，大小約為4786～5905 bp。各類型豬博卡病毒的基因組結(jié)構(gòu)基本一致，基因組編碼3個開放閱讀框（ORF），ORF1（5’末端）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，有4個亞基因組，并存在著與病毒滾環(huán)復制、解螺旋酶以及三磷酸腺苷酶活性相關(guān)的保守序列；ORF2（3’端）編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2，有2個亞基因組，VP1編碼的序列內(nèi)存在與病毒感染性相關(guān)的磷脂酸A2序列（與Ca2+結(jié)合環(huán)及催化殘基相關(guān)序列相連）[4]；ORF3（中間序列）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP，其主要功能還不明確。VP1/VP2是PBoV的主要抗原基因。但Cheung等[5]研究發(fā)現(xiàn)PPV4的序列為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長度約5905 bp。

當前國際上對豬博卡病毒尚無統(tǒng)一的分類，筆者參考GenBank上登錄的豬博卡病毒全序列暫將其為以下幾個基因型：豬類博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）基因組大小4786 bp（GenBank Number:HQ223038）；豬博卡病毒1型（(Porcine Bocavirus Type 1, PBoV1）基因組大小5267 bp（GenBank Number:HQ291308）；豬博卡病毒2型（(Porcine Bocavirus Type 2, PBoV2）基因組大小5186 bp（GenBank Number:HM053694）；豬博卡病毒3型（(Porcine Bocavirus Type 3, PBoV3）基因組大小4710 bp（GenBank Number:JF713714）；豬博卡病毒4型（(Porcine Bocavirus Type 4, PBoV4）基因組大小4125 bp（GenBank Number:JF512473）；豬博卡病毒5型（(Porcine Bocavirus Type 5, PBoV5）基因組大小5076 bp（GenBank Number:JN831651）；豬細小病毒4型（Porcine Parvovirus Type4, PPV4）基因組大小5400 bp（GenBank Number:HEN0922-5400）。

3 流行病學

豬是已知豬博卡病毒唯一的易感動物。病豬和帶毒豬是其主要傳染源，不同年齡、性別的家豬和野豬均可感染。自2009年首例PBoV在瑞典被發(fā)現(xiàn)以來，目前PBoV還只在瑞典、北愛爾蘭、美國和中國的家豬被檢測并分離。此外，在羅馬尼亞和烏干達的野豬體內(nèi)也檢測到了該病毒[6-7]。2009年翟少倫等檢測了來自浙江、江西、安徽、河北、河南、江蘇、北京、上海、新疆9省市自治區(qū)的送檢病料，PBoV的檢出率在12.5%～ 88.9%之間，并且在健康的豬樣品中也檢測到PBoV的存在，檢出率為7.3%（3/41）。2010年Shan等[8]在來自上海、江蘇、安徽、山東以及貴州的共計340份健康豬病料中檢測到PBoV，其陽性率為45%～75%。表明貴州省存在豬博卡病毒的流行。2010年Cheng等共檢測了397份臨床病料，檢出PBoV的陽性率為12.59%。黃律等[9]檢測了2006－2010年間來自安徽、福建、廣西、河南、河北、湖北、江蘇、江西、山東、上海、浙江以及新疆的705份樣品（包括發(fā)病豬樣品573份，健康豬樣品132份），發(fā)病豬樣品中PPV4檢出率（2.09%，12/573）顯著高于健康豬樣品（0.76%，1/132）。這些研究表明目前我國豬博卡病毒的檢出率非常高。

4 臨床癥狀

豬博卡病毒可引起豬呼吸道與腸道感染，使之出現(xiàn)支氣管炎、肺炎以及急性或慢性胃腸炎癥狀，引發(fā)流產(chǎn)、死胎，甚至死亡。哺乳仔豬多在出生 2～3 d后出現(xiàn)劇烈的腹瀉，排淡綠色、黃綠色或灰白色水樣糞便，部分仔豬有嘔吐癥狀，病豬迅速脫水消瘦，精神沉郁、被毛粗亂，少食或不食，多數(shù)于 5～7 d內(nèi)死亡，10 日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達 50%～80%，隨日齡的增加死亡率降低。病死豬消瘦、脫水、胃黏膜充血，有時有出血點，小腸黏膜充血腸壁變薄無彈性，內(nèi)含水樣稀便，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。此外，豬博卡病毒對發(fā)生豬圓環(huán)病毒病與腹瀉性疫病的豬只具有促進與加重病情的作用[10]。

5 診斷方法

5.1 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）

首先將待檢細胞用未標記的抗體處理，使之與特異的抗原形成復合物，然后再用抗抗體的熒光標記抗體著色，可檢測出特異抗原在細胞中的存在部位，并具有熒光增強效應。McKillen等[11]在建立PBoV原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)時，為了鑒定豬博卡病毒在細胞上的生長情況，構(gòu)建了間接免疫熒光方法，并在豬原代腎細胞的細胞核發(fā)現(xiàn)了綠色熒光集結(jié)。

5.2 血清學診斷方法

李彬等[12]對PBoV1的NP1基因進行克隆與表達載體構(gòu)建，通過表達后，其表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量為46 ku，通過Western Blot，結(jié)果顯示表達的NP1蛋白能與His抗體發(fā)生特異性的免疫反應，表明原核表達的NP1蛋白具有良好的反應原性，可作為診斷抗原的候選蛋白。為豬博卡病毒的血清學診斷方法奠定了理論基礎(chǔ)。黃律[13]首次對PPV4的各個ORF框進行真核表達，研究發(fā)現(xiàn)只有PPV4的NS所表達的蛋白能夠和PPV4陽性血清反應，對NS蛋白進行原核表達得到的蛋白要遠小于NS實際編碼蛋白的大小，僅約26 ku。最終純化獲得的PPV4 NS蛋白可用于監(jiān)測臨床血清中的抗體水平。

5.3 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)[14]因其較好的敏感性、特異性和重復性，常被用來診斷病毒的DNA。博卡病毒的型內(nèi)基因組序列相對保守，非常便于PCR引物設(shè)計，PBoV目前主要采用NP、NS1片段設(shè)計引物進行PCR檢測。翟少倫等[15]首次建立了PBoV的PCR診斷方法，該法特異性強，敏感度高且重復性好。在對191份臨床樣品檢測時，陽性率達39.3%（75/191），敏感性達32.2 ng/μL。該PCR方法的建立為豬博卡病毒分子流行病學的研究提供了快捷有效的檢測方法（普通PCR儀即可操作）。此外，還可有效防止PBoV在我國的全面流行，尤其是在跨區(qū)引種時具有重要的作用。胡軍勇等[16]建立的PCR診斷方法，具有良好的穩(wěn)定性、特異性、敏感性，在對248份病料樣品檢測時，陽性率達69.35%（172/248）。該方法對PBoV的最低檢測量為213.6拷貝，為臨床診斷和流行病學調(diào)查提供了有力的支持。

5.4 實時聚合酶鏈式反應

實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）省去了普通PCR的凝膠成像步驟，大大縮短了病毒的檢測時間。Li等[17]建立了PBoV1的RT-PCR診斷方法，在對258份臨床樣品進行檢測時，陽性率達44.2%（114/258），敏感性達20個質(zhì)粒拷貝，特異性與重復性均較好。黃律等[18]建立了PPV4的Taq Man熒光定量PCR診斷方法，該法快速敏感且特異性高，在6.73×109copies/μL～6.73×101copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998；對PPV4的最低檢測限為6.73×101copies/μL。該方法的建立不僅可用于臨床病料的檢測，還為PBoV的體外敏感細胞的篩選以及病毒器官嗜性的研究提供了快捷敏感的分子檢測技術(shù)，大大促進了PBoV分子流行病學的發(fā)展，為今后PBoV的深入研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

5.5 環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)

環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)（LAMP）是一種新型的核酸擴增技術(shù)，依賴4條特異設(shè)計的引物和一條具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、高特異性地擴增靶序列。近年來該法被廣泛應用于病原體的檢測。江蘇省農(nóng)科院的李彬等發(fā)明了豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，最低可檢測到10個拷貝。其LAMP檢測試劑盒不需要先進的儀器，避免了現(xiàn)有豬博卡病毒檢測手段存在的問題，并且具有特異性強、敏感度高、檢測周期短、操作簡便以及易于推廣等優(yōu)點。該方法的有效建立，豐富了豬博卡病毒的分子流行病學研究的方法，且大大縮短了豬博卡病毒的檢測時間，進一步減少了實驗過程中的污染機會（只需一步即可完成實驗），為大規(guī)模的豬博卡病毒檢測調(diào)查提供了有效的方法。

6 防治方法

6.1 對癥治療

豬博卡病毒可導致哺乳仔豬嚴重腹瀉甚至脫水死亡，對于發(fā)病豬需進行補液治療，方法如下：口服法，按飲水加成品的口服補液鹽 30 g/kg 和適當抗生素（如慶大霉素等）灌服（2次/d）；腹腔注射法，根據(jù)豬只大小采用 5%葡萄糖生理鹽水 200 ～300 mL、5% 碳酸氫鈉注射液 30 ～50 mL，腹腔注射（1 次/d）連續(xù)注射 2 ～4 d。相關(guān)研究表明，以雞新城疫Ⅰ系疫苗為干擾源注射，可明顯減輕相關(guān)病毒性腹瀉癥狀。1 瓶雞新城疫疫苗( 按 500 羽/份計) 可注射 15 日齡以內(nèi)的仔豬 10 頭，可注射 15 日齡以上仔豬（10 kg左右） 5 頭。此外，發(fā)病豬場在仔豬出生 1 ～2 d 內(nèi)，分別肌注長效頭孢噻夫晶體注射液 0.2 mL/頭，肌注右旋糖苷鐵 1 ～ 2 mL/頭，可增強仔豬抵抗力，明顯降低豬只死亡率。

6.2 母豬返飼

目前市場上尚無商品化的豬博卡病毒疫苗，規(guī)模化豬場及散養(yǎng)戶需做好豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病、豬喘氣病、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性胃腸炎及流行性腹瀉等其他疫病的綜合防治。因此，需提前對母豬進行返飼以預防該類疫病，該法效果良好，但應盡量提早。所謂返飼，即采集仔豬糞便或病豬的腸內(nèi)容物，研磨后加水浸泡 30 min，加入適量抗生素類藥物（如阿莫西林），經(jīng)多次過濾后與飼料攪拌均勻，對產(chǎn)前 6 周以內(nèi)的母豬進行飼喂，每天1次，連續(xù)飼喂3 ～ 4 d，間隔 3 周后再重復飼喂一個階段。采集腹瀉糞便時需要注意保持新鮮無腐敗無污染，返飼母豬飼料中需適當加入藥物進行保健。

6.3 加強飼養(yǎng)管理

精心引種，注意不從疫區(qū)引種，堅持自繁自養(yǎng)，最好建立無特定病原體豬群，以免病原體傳入和擴散，同時還得實行早期隔離斷奶。對發(fā)病豬進行隔離治療，最好淘汰，對病死豬進行科學處理，搞好畜舍衛(wèi)生，定期消毒。因博卡病毒對碘制劑較為敏感，豬場可使用碘制劑類等加強消毒，并在欄舍和潮濕處撒生石灰，進行干燥消毒。同時還要注意母豬防暑降溫、仔豬保溫、畜舍通風干燥。

綜上所述，豬博卡病毒作為一種新型的病毒，其許多特性都不同于傳統(tǒng)的細小病毒科病毒，目前人們對該病毒的研究還只停留在初級階段。對豬博卡病毒的防控不僅僅是要控制它的發(fā)生，還必須與遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境和氣候以及飼養(yǎng)管理等學科相配合，從不同角度開展研究，進而控制豬博卡病毒的發(fā)生和發(fā)展，確保規(guī)?；i場的生產(chǎn)安全。

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