• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    萊茵衣藻葉綠體型磷酸甘油醛脫氫酶過表達對其儲能物質生產(chǎn)的影響?

    2019-01-04 20:21:44曹旭鵬苑廣澤
    關鍵詞:衣藻藻株萊茵

    朱 振, 曹旭鵬, 苑廣澤, 劉 嬌, 薛 松, 田 晶??

    (1.大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧 大連116034;2.中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連116032; 3.齊魯工業(yè)大學生物工程學院,山東 濟南 250353)

    微藻種類繁多且代謝系統(tǒng)豐富多樣,特別是真核藻類,具有巨大的基因調(diào)控潛力,被認為是最具潛力的下一代生物質提供者[1-2]。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是目前研究最充分的微藻:可直接獲得的野生或人工株系超過3 000株(chlamycollection.org中心保藏),其核基因組編碼基因超過15 000個;在phytozome(phytozome.jgi.doe.gov)的V5.5版本數(shù)據(jù)庫中收錄超過130個典型培養(yǎng)條件下的轉錄組數(shù)據(jù);葉綠體和線粒體基因組也已完成測序。作為光合真核微藻,其表達系統(tǒng)具有翻譯后修飾能力和細胞器表達能力(葉綠體和線粒體),兼具植物和微生物表達系統(tǒng)的優(yōu)勢。上述萊茵衣藻的特點為其在基因工程、代謝工程和合成生物學方面的應用提供了豐富的選擇性[3]。

    常見的真核微藻表達系統(tǒng)分為2類。一種是利用細胞器作為表達系統(tǒng),如將外源基因重組到葉綠體DNA中進行表達[4-5],其優(yōu)點是外源蛋白可以在葉綠體內(nèi)高含量存在,其缺點是葉綠體基因組中可操作的位點及可插入片段長度、數(shù)量有限。另一種是利用核表達系統(tǒng),將外源基因重組到核基因組,在胞質內(nèi)表達蛋白。相比而言,對真核微藻核基因組的操作選擇性更為多樣,且胞質內(nèi)蛋白表達的方式更豐富,可以根據(jù)不同目的選擇不同的策略。

    在光合微藻和高等植物中,1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)是參與光合作用和光呼吸過程的關鍵酶,也是胞內(nèi)含量最豐富的蛋白質。該蛋白有4個大亞基(RbcL)和4個小亞基(RbcS)組成,其中RbcL是葉綠體編碼蛋白,RbcS是核編碼蛋白[6]。已有研究表明,萊茵衣藻基因組中有2個RbcS編碼基因,相似度極高,其中RbcS2(Cre02.g120150.t1.1)具有表達量高且相對穩(wěn)定的特點[7],因此已被廣泛用于微藻重組蛋白表達載體的構建[1]。

    內(nèi)外源基因的表達按其目標來說可以分為2類:一類是以蛋白本身作為產(chǎn)物,如利用代謝工程、合成生物學等手段構建細胞工廠,用來高效獲得正確折疊的蛋白;另一類是以研究基因/蛋白的功能為目標的,作為工具研究生物學機制。相比之下,微藻內(nèi)外源基因表達的第二類應用具有更廣闊的需求。影響內(nèi)外源基因在微藻細胞中表達效率的因素有很多,其中,啟動子在基因表達系統(tǒng)中就是關鍵元件[2],有研究表明,熱休克蛋白Hsp70A啟動子能提升外源基因的表達,并能緩解衣藻中轉入基因的沉默[8]。Schroda等利用熱休克蛋白Hsp70A啟動子的特點,在2002年提出構建Hsp70A-RbcS2嵌合啟動子,隨后,在Hsp70A-RbcS2上引入更多的調(diào)控組件[9],包括RbcS2的第一個內(nèi)含子和3’-UTR等,使Hsp70A-RbcS2逐漸成為萊茵衣藻蛋白表達效果最好且應用最為廣泛的系統(tǒng)[1]。Invitrogen公司基于上述研究推出了GeneArt?ChlamydomonasEngineering Kits表達系統(tǒng),主要是在RbcS2啟動子引發(fā)的表達系統(tǒng)中加入了不同的調(diào)控元件,其中pChlamy_1表達系統(tǒng)中引入了RbcS2的第一內(nèi)含子序列,提升了外源蛋白的表達量;pChlamy_3表達系統(tǒng)進一步在pChlamy_1終止密碼子后引入了RbcS2基因的3’-UTR序列,進而實現(xiàn)了相對穩(wěn)定的蛋白表達量。

    作為一種典型的研究體系,萊茵衣藻氮脅迫條件下儲能物質的積累規(guī)律一直為大家所關注。本實驗室前期工作中,借助修飾蛋白質組技術識別出萊茵衣藻在受到氮脅迫時,葉綠體型磷酸甘油醛脫氫酶(Glycera-ldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)發(fā)生了顯著的泛素化[10]。通常GAPDH作為糖酵解的關鍵酶參與糖的利用,并且葉綠體型GAPDH,在卡爾文循環(huán)中也是光合固碳的重要環(huán)節(jié)。那么葉綠體型GAPDH對儲能物質的積累起到何種作用?為了探索其生理功能,本研究以經(jīng)典的野生型萊茵衣藻藻株cc-137c為宿主,分別以上述2種不同表達水平的表達系統(tǒng)為基礎,構建相應的轉化株,考察其生長和儲能物質積累過程的變化,進而對葉綠體型GAPDH的功能加以推測。

    1 材料與方法

    1.1 藻株及質粒介紹

    萊茵衣藻cc-137c購買自Chlamycollection中心,編號cc-124 wild type mt-[137c]。pChlamy_1直接來源于Invitrogen公司,pChlamy_3載體在pChalmy_1的基礎上利用RF克隆技術[11]插入3’-UTR序列并測序驗證。研究使用的GAPDH(NCBI:XM_001689819.1)委托金為智公司合成獲得,GAPDH基因片段為1 144 bp。萊茵衣藻使用標準TAP培養(yǎng)基[12],24 h連續(xù)光照,光強為50 μmol·m-2·s-1,搖床振蕩培養(yǎng),轉速為100 r/min。

    1.2 方法

    1.2.1 轉化質粒的構建 本文使用2種表達載體構建重組質粒pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH,其圖譜如圖1所示。利用人工合成得到pChlamy_1-GAPDH,通過PCR擴增技術得到萊茵衣藻cc-137c藻細胞中的3’-UTR(234 bp)片段,利用RF克隆方法,其中RF的第二步(RF2)反應體系如表1所示,獲得pChlamy_3-GAPDH。上述PCR反應中所用的Cr3U-F/R引物序列如表2所示,且均是在TakaraPrimeSatrmaxPremixkit的50μL體系中進行。

    圖1 pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH重組質粒圖Fig.1 The map of pChlamy_1-GAPDH and pChlamy_3-GAPDH

    表1 重組質粒pChlamy_3-GAPDH的RF2反應體系Table 1 Recombinant plasmidspChlamy_3-GAPDH of RF2 clone reaction system

    萊茵衣藻RbcS2的3’-UTR序列擴增過程如下:將0.5 mL生長至指數(shù)生長期末期的cc-137c細胞(OD750吸光度值約1.0)離心收集,用20 μL無菌水重懸,100 °C加熱裂解5 min。冷卻后,取1 μL作為模板進行PCR擴增。

    將純化后的RF克隆產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞E.coliDH5α,然后涂布于含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)皿上,37 °C過夜培養(yǎng),挑取單克隆,提取質粒后由寶生物公司進行測序驗證。

    表2 引物序列Table 2 Primer sequence

    1.2.2 重組質粒轉化及轉化藻株篩選 各取3 μg待轉化重組質粒,利用限制性內(nèi)切酶PvuI進行線性化,用于電擊轉化。具體步驟如下:將萊茵衣藻cc-137c接種至TAP培養(yǎng)基中,接種OD750約0.05,培養(yǎng)至OD750至0.3~0.5之間,取15 mL藻細胞,離心取上清,用250 μL 40 mmol/L的蔗糖TAP溶液重懸藻細胞,加入電擊杯中,再加入2~3 μg的線性化質粒,輕輕振蕩混勻(空白對照不加質粒,只加對應體積的無菌水),使用Bio-Rad?Gene Pulser?II進行電轉,參數(shù)為:600 V,50 μF,電阻無窮大。電擊結束后,按照每125 μL接種至5 mL 40 mmol/L蔗糖TAP溶液的比例,在六孔板中光照培養(yǎng)24 h。隨后,取1~2 mL藻液在2 500 r/min下離心10 min,用150 μL的40 mmol/L蔗糖TAP溶液重懸藻細胞,涂布在10 μg·mL-1潮霉素平板進行初篩。隨后,對2種轉化株的單克隆分別進行單藻落PCR驗證。第一輪引物為載體上的通用引物PC-F/R;第二輪為陽性克隆使用對應的特異性引物GAPDH-F/R,進行第二次PCR擴增驗證。引物序列如表2所示。

    1.2.3 轉化藻株培養(yǎng)

    1.2.3.1 轉化藻株在TAP平板培養(yǎng) 挑選每種轉化藻株中的陽性克隆,在含有抗生素的TAP瓊脂培養(yǎng)基上劃線,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光強為50 μmol photons·m-2·s-1,在光照14 h∶黑暗10 h光照條件下,倒置培養(yǎng)2~3 d,觀察藻細胞在TAP固體培養(yǎng)基上的生長情況。

    1.2.3.2 轉化藻株在TAP溶液培養(yǎng) 轉化藻株在含有10 μg·mL-1潮霉素的液體TAP培養(yǎng)基中進行5代傳代培養(yǎng)后,用于進一步評價。為了保證評價過程中藻細胞不受到抗生素的影響,選擇在正常的TAP培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,在24 h光強為50 μmol photons·m-2·s-1的光照條件下,將起始密度OD750在0.07~0.09的100 mL微藻培養(yǎng)于250 mL搖瓶中,設置3個平行。在100 r/min搖床上連續(xù)培養(yǎng)5 d,每天定時取樣測定OD750、葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm、干重。取樣遵循不放回原則,同時培養(yǎng)野生型萊茵衣藻cc-137c作為對照。剩余藻細胞冷凍離心,放入液氮中速凍,在-80 °C冰箱保存。

    1.2.4 細胞生長的測定 微藻細胞密度:采用Jasco V-530紫外分光光度計測定,測定波長為750 nm,當藻液吸光度值大于1時,進行稀釋重新測定。

    細胞干重測定:取5~20 mL 藻液,4 000 r/min離心10 min后,棄上清液,用0.5 mol·L-1碳酸氫銨溶液洗滌,過濾到預先烘干并稱重的玻璃纖維濾膜上,烘干(60 ℃,24 h)后稱重[13],計算干重(mg·mL-1)。

    1.2.5 葉綠素熒光的測定 采用Water-PAM(Walz,德國)葉綠素熒光儀測定光合系統(tǒng)II(Photosystem II,PS II)最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm。具體過程為:微藻細胞經(jīng)過暗適應10 min后,先用檢測光(ML,15 μmol·m-2·s-1)照射,測定初始熒光值為Fo;再用強飽和脈沖光(SP, 0.6 s, 330 μmol·m-2·s-1)激發(fā),測定最大熒光值為Fm;最后計算出PS II的最大光化學量子產(chǎn)量[14],即Fv/Fm值,F(xiàn)v/Fm= (Fm-Fo)/Fm。

    1.2.6 Westernblot驗證 在每種藻細胞中加入1 mL裂解液和蛋白酶抑制劑[10],放在組織細胞破碎儀(SCIENTZ-48)進行破碎,完成后在冰上放置1~2 h,以便藻細胞被充分裂解,冷凍離心取上清液,得到蛋白樣品,并利用考馬斯亮藍法測定每個樣品的蛋白濃度。將蛋白和loadingbuffer(Coomassie Brilliant Blue G-250)混勻加熱變性,在10%的SDS-PAGE膠中進行恒壓90 V電泳,完成后,切去SDS-PAGE膠的濃縮膠部分,將與膠大小相同的PVDF膜放入甲醇溶液中活化10 min,組裝好PVDF膜和膠,在電轉儀(Bio-rad)中進行電轉,設定250 mA恒流電轉1 h,完成后,將PVDF膜在5%牛奶中封閉1 h,用TBST溶液洗膜后,放入一抗溶液中孵育過夜,同種樣品分別孵育在His-Taq(ABclonal.NO:AE003)和GAPDH(CST 5174,XP? Rabbit)一抗中,抗體均以1∶1 000比例稀釋,一抗孵育結束后,洗膜,放入二抗稀釋液中孵育2 h,完成后洗膜,采用Tanon TMHigh-sig ECL Western Blotting Substrate顯色液顯色,在Multifunctional imager:FUSION-FX5-820進行曝光[15]。

    1.2.7 總糖測定 稱量2~3 mg的干燥藻粉置于5 mL EP管中,加入2 mL去離子水,超聲破碎細胞,將藻細胞破碎液定容至5 mL。配制葡萄糖濃度為0,0.02、0.04、0.06、0.08和0.10溶液各1 mL,各藻液樣品也稀釋為1 mL,每個樣品加入5 mL蒽銅試劑,振蕩混勻后沸水浴10 min。水浴結束后,以去離子水為空白調(diào)零,于621 nm處測定吸光度[16]。制作“葡萄糖濃度-吸光度”標準曲線得到回歸方程。計算藻細胞中總糖含量,總糖含量(%)=稀釋后的葡萄糖濃度(mg·mL-1)×稀釋倍數(shù)×定容體積/藻粉質量(mg)×100%。

    1.2.8 脂肪酸測定 按照文獻[17-18]介紹的方法測定藻細胞中脂肪酸組分和含量,稱取5 mg左右藻粉于10 mL 圓底燒瓶,加入內(nèi)標碳十七烷酸甘油三酯(SigmaAldrich),并加入5 mL的2%硫酸-甲醇溶液(v/v),70°C水浴1 h,轉酯化的反應結束后,待樣品冷卻,加入0.75 mL去離子水和2 mL正己烷,磁力攪拌器上攪拌1 min,靜置分層,取上層己烷層加入到含有適量無水硫酸鈉的離心管中除水,轉移到樣品瓶中采用帶有FID檢測器的Agilent GC 7890A進行測定。

    2 實驗結果與分析

    2.1 質粒構建PCR結果

    所構建的質粒經(jīng)過測序,堿基序列與設計一致。

    2.2 轉化藻株的初步篩選與PCR驗證

    在抗性平板中,涂布第二天即出現(xiàn)肉眼可見轉化株,如圖2E、F所示,該轉化株出現(xiàn)時間要早于試劑盒以及本實驗室其它轉化實驗中約3~5 d。在抗生素初篩基礎上挑選出優(yōu)先生長出來的單克隆,進行PCR的驗證,如圖2所示:A和B是代表pChlamy_1-GAPDH轉化株,C和D是代表pChlamy_3-GAPDH轉化株。

    (圖A~D為轉化株的PCR驗證結果,其中A、C使用的是載體通用引物對,B、D使用的是外源GAPDH特異性引物對,箭頭所示為目標條帶。圖E和F為挑選出pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH轉化株在抗性平板生長情況照片。A~D. Results of PCR verification by general primers and gene specific primers. A、C: By general primers; B、D: By gene specific primers. E and F. Transformants of pChlamy_1-GAPDH and pChlamy_3-GAPDH on agar plates.)

    圖2 轉化藻株的PCR驗證和轉化藻株的平板培養(yǎng)
    Fig.2 The PCR verification of transformed algae andthe cultivation of transformed algae

    對比每種轉化株陽性克隆的個數(shù),如表3所示,其中pChlamy_1-GAPDH重組質粒轉化率達22%,pChlamy_3-GAPDH重組質粒轉化率達27%,這兩個體系的轉化率符合GeneArt?ChlamydomonasEngineering Kits說明書中介紹通常約有20%的陽性克隆。

    表3 轉化藻株的PCR篩選Table 3 The PCR screen of transformed algae

    Note:①Transformant;②PCR monoclonal;③Positive clone;④Transformation rate

    2.3 轉化株液體培養(yǎng)結果分析

    野生型cc-137c(WT),pChlamy_1-GAPDH,pChlamy_3-GAPDH 3種藻株連續(xù)培養(yǎng)5 d,其葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm變化如圖3所示。3種藻株的Fv/Fm在相同的水平,不存在顯著差異。

    圖3 轉化株和WT的葉綠素熒光變化Fig.3 Changes in chlorophyll fluorescence of transformed algae and WT

    這3種藻株的OD750盡管略有差異,但變化趨勢基本保持一致,如圖4A所示,均在培養(yǎng)第3天時,細胞密度達到最大值,即OD750達到1.9~2.0,隨后進入生長穩(wěn)定期;如圖4B所示,對比各干重變化趨勢,在培養(yǎng)第3天時,轉化株pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH的干重均達到0.6 mg·mL-1以上,而WT的干重在0.53 mg·mL-1左右。

    2.4 轉化株中GAPDH蛋白Western blot驗證

    經(jīng)過優(yōu)化,分別使用40 μg pChlamy_1-GAPDH總蛋白和150 μg pChlamy_3-GAPDH總蛋白進行Western blot驗證。結果表明,pChlamy_1-GAPDH的表達量變化較大,如圖5A中a-1和a-2所示,在第一天時含量較低,但是隨著細胞生長至穩(wěn)定期而明顯增多;相比而言,整體上pChlamy_3-GAPDH的表達量處于比較穩(wěn)定水平,相對豐度如圖5A中b所示,未有pChlamy_1-GAPDH的表達量高。這也與Invitrogen公司對這兩種表達系統(tǒng)的介紹相一致,pChlamy_3相對于pChlamy_1能夠提供更穩(wěn)定的外源蛋白表達。

    (A: 轉化株和WT的生長曲線變化; B: 轉化株和WT的干重變化。A: Changes in the growth curve of transformed algae and WT; B: Changes in the dry weight of transformed algae and WT.)

    圖4 轉化株和WT的生長曲線和干重變化
    Fig.4 Changes in the growth curve and dry weight of transformed algae and WT

    2.5 總糖含量測定

    WT、pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH 3種藻株的總糖含量如圖5A所示,表現(xiàn)出了明顯的規(guī)律性。其中WT相對轉化株總糖含量最少,約占干重的9%~13%;pChlamy_1-GAPDH和WT在起始階段總糖含量在同一水平,但伴隨著GAPDH表達量的提升,而進入一個較高水平,在第二天達到干重的17%,隨后有所下降;而pChlamy_3-GAPDH的總糖含量變化趨勢與WT相接近,但是一致保持高于WT,從接種時的17%下降至指數(shù)生長期的11%,隨著進入穩(wěn)定期而逐漸回升。

    2.6 脂肪酸含量測定與分析

    轉化株與WT的脂肪酸含量變化如圖5B所示。因為是富營養(yǎng)培養(yǎng),所以WT中脂肪酸含量保持穩(wěn)定,在10%~11%左右;pChlamy_1-GAPDH轉化株的脂肪酸含量呈現(xiàn)出與生長曲線類似的變化趨勢,由初始時與WT相同水平的10%含量,在第4天脂肪酸含量開始迅速上升至13%,并維持,而這也與該階段外源GAPDH表達量的變化相一致;相比之下,pChlamy_3-GAPDH轉化株的脂肪酸含量一直維持穩(wěn)定且高水平,脂肪酸含量在15%左右。

    進一步分析脂肪酸構成的變化,如圖6和7所示。對比轉化株主要發(fā)生變化的脂肪酸組分,發(fā)現(xiàn)pChlamy_3-GAPDH脂肪酸含量增加最明顯的主要包括C16:0、C16:4n3、C18:3n3這3種脂肪酸,其中C16:0是脂肪酸代謝的起始階段的脂肪酸代表,而C16:4n3,C18:3n3是被認為在葉綠體中所特有的脂肪酸[18];pChlamy_1-GAPDH的脂肪酸主要是在C16:0,C16:4n3和C18:2n6,脂肪酸含量的上升與GAPDH蛋白表達量相關,其中C16:0和C16:4n3是隨著轉化株的培養(yǎng)而增高的。

    (A:轉化株和WT總糖含量變化和轉化株GAPDH western blot;a-1:pChlamy_1-GAPDH培養(yǎng)第一天樣品western blot結果,a-2:pChlamy_1-GAPDH培養(yǎng)第三天樣品western blot結果; b:pChlamy_3-GAPDH培養(yǎng)第四天樣品western blot結果;G:代表目的蛋白GAPDH條帶,C:代表內(nèi)參蛋白條帶。B:轉化株和WT總脂肪酸含量變化。A: Changes of carbohydrate content of transformed algae and WT and western blot of GAPDH; a-1: Western blot results of the pChlamy_1-GAPDH in the first day, a-2: Western blot results of the pChlamy_1-GAPDH in the third day; b: Western blot results of the pChlamy_3-GAPDH in the fourth day; G: The target protein GAPDH, C: The internal control protein. B: Changes of lipid content of transformed algae and WT.)

    圖5 轉化株和WT總糖和總脂肪酸含量變化以及轉化株GAPDH westernblot驗證

    Fig.5 The total carbohydrate and lipid content and westernblotof GAPDH

    圖6 轉化株和WT的脂肪酸各組分的含量Fig.6 The content of each composition of fatty acids in dry weight of transformants and WT

    圖7 轉化株和WT的脂肪酸組成Fig.7 Fatty acid composition of transformed algae and WT

    結合2.5中的結果,說明GAPDH的轉入,能夠顯著促進萊茵衣藻固碳后儲能物質的積累。如表4所示,pChlamy_3-GAPDH中的最大脂肪酸日積累量為44.8 mg·L-1,相對于WT提高了55.2%;而pChlamy_1-GAPDH中最大脂肪酸日積累量為33.5 mg·L-1,相對于WT提高了15.9%。同時,以總糖和總脂肪酸含量之和作為總儲能物質生產(chǎn)的指標,進行對比,發(fā)現(xiàn)轉化株的最大日儲能物質量分別為84.2和91.8 mg·L-1,通過比較各種藻株的最大儲能物質產(chǎn)率,發(fā)現(xiàn)2種轉化藻株的總體固碳能力均有明顯提高,相對于WT分別提高了60.7%和75.2%。

    表4 GAPDH轉化對cc-137儲能物質生產(chǎn)能力的影響Table 4 Effectsof exogenous GAPDH on the energy storage compounds productivity

    注:a:脂肪酸最大產(chǎn)率的提高,b:最大固碳速率的提高;**表示數(shù)據(jù)具有極顯著性差異。

    Note:The maximum yield of lipid increased, b: the maximum carbon sequestration rate increases. Dates are shown as** denote extremely significant difference (p<0.01).

    3 討論

    微藻作為最有潛力的第三代生物質能源提供者,如何實現(xiàn)其高效光合固碳生產(chǎn)能源制品,一直是微藻技術發(fā)展領域的重點方向[19-20]。同時,作為一種重要水產(chǎn)餌料,微藻的高效定向培養(yǎng)也一直是拓寬餌料應用的重要一環(huán)[21-22]。這二者的發(fā)展均離不開微藻光合培養(yǎng)效率的提升。本文也正是基于此目的,希望從關鍵固碳蛋白的角度對這一領域的發(fā)展做出貢獻。

    光合固碳離不開卡爾文循環(huán),人們在試圖提升微藻和植物的固碳效率過程中,常常將關注點集中在CO2直接固定的Rubisco復合體上,因為這是由無機碳變?yōu)橛袡C碳的第一步。在植物與微藻中,Rubisco不僅僅是固碳的關鍵酶,也是重要的氮庫,在氮缺乏條件下,Rubisco將優(yōu)先發(fā)生降解釋放氮元素用于其它必需生理過程。因此,其含量具有很高的冗余度。相比而言,卡爾文循環(huán)中其他酶的研究則相對較少。GAPDH是卡爾文循環(huán)中光合產(chǎn)物葡萄糖分解過程中的重要酶[23]。一般來說,GAPDH在生物體內(nèi)表達水平穩(wěn)定,是研究轉錄和蛋白表達重要的內(nèi)參,但是我們前期實驗發(fā)現(xiàn),葉綠體型GAPDH在氮缺乏條件下會顯著的發(fā)生聚泛素化,這引起了我們對該蛋白的關注。相比胞質內(nèi)的GAPDH,人們對葉綠體型GAPDH的功能知之甚少。因此,本文工作將首先從GAPDH的過表達入手,進行探索以期加深對葉綠體型GAPDH的認識。

    由于萊茵衣藻內(nèi)外源蛋白的表達具有一定的不穩(wěn)定性和隨機性,我們選用了目前商用典型的2個表達體系:pChlamy_1和pChlamy_3,其中pChlamy_1只具有萊茵衣藻RbcS2部分表達調(diào)控序列,表達蛋白的量具有一定的生長相關性,而pChlamy_3在pChlamy_1的基礎上增加了3’-UTR序列,能夠使外源基因得到穩(wěn)定表達。因此,分別構建了上述2個系統(tǒng)的轉化株,通過比較,發(fā)現(xiàn)2種轉化株儲能物質的含量均提高,但是對微藻儲能物質積累的影響規(guī)律并不相同。具體而言,在持續(xù)穩(wěn)定表達外源GAPDH的pChlamy_3-GAPDH轉化株中,儲能物質得到了穩(wěn)定且持續(xù)的生產(chǎn),最終獲得了更高的產(chǎn)率;而pChlamy_1-GAPDH中GAPDH的表達量與生長關聯(lián),因此,當GAPDH進入高表達期時,儲能物質才迅速提升。從結果可以看出,過表達葉綠體型GAPDH可明顯提升轉化株的儲能物質生產(chǎn)效率。

    綜合實驗結果,過表達葉綠體型GAPDH不僅能夠強化CO2轉化成碳水化合物,并且能夠進一步通過強化糖酵解過程使碳水化合物向油脂轉化。這為我們通過基因工程手段及合成生物學技術開發(fā)高效儲能物質生產(chǎn)工程藻株提供了有力的借鑒。同時,在后續(xù)工作中,我們將延續(xù)這一思路,考察卡爾文循環(huán)中其它幾個與碳水化合物代謝相關酶過表達的影響,如fructose-bisphosphate aldolase(EC: 4.1.2.13)。

    4 結論

    (1)構建了含有葉綠體型GAPDH基因,具有不同表達模式的2種轉化株,通過對其生長和生物質組分的測定,發(fā)現(xiàn)葉綠體型GAPDH的過表達將強化光合儲能物質生產(chǎn),其中具有RbcS2的3’-UTR的pChlamy_3-GAPDH表達系統(tǒng)更為穩(wěn)定。

    (2)與WT相比,轉化株pChlamy_1-GAPDH和pChlamy_3-GAPDH分別實現(xiàn)了脂肪酸最大產(chǎn)率15.9%和55.2%的提升,總儲能物質積累量60.7%和75.2%的提升,說明在萊茵衣藻中提升葉綠體型GAPDH的表達量能夠顯著的促進其儲能物質生產(chǎn)效率的提升。

    猜你喜歡
    衣藻藻株萊茵
    中性脂含量高的微擬球藻藻株的快速篩選?
    美萊茵金屬公司的Lynx步兵戰(zhàn)車
    軍事文摘(2022年21期)2022-11-17 13:05:54
    德國萊茵TüV集團
    基于提高乙醇產(chǎn)率的常壓室溫等離子體微藻誘變育種
    衣藻二氧化碳濃縮機制及其調(diào)控的研究進展
    長心卡帕藻兩種顏色藻株的生長差異研究
    德國萊茵TüV集團
    德國萊茵TüV集團
    小球藻的沼液馴化、抗生素敏感性分析和選擇標記篩選
    不同光照條件下氮濃度對衣藻生長及油脂積累的影響
    69av精品久久久久久| 在线观看66精品国产| 国产午夜精品论理片| 久久国产精品人妻蜜桃| 99久国产av精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 毛片一级片免费看久久久久 | 波多野结衣高清无吗| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久午夜福利片| 一个人免费在线观看电影| 国产精品一及| 久久亚洲精品不卡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 1000部很黄的大片| 三级国产精品欧美在线观看| av天堂中文字幕网| 99久久九九国产精品国产免费| 18+在线观看网站| 免费人成在线观看视频色| 国产精品一区二区免费欧美| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美精品综合久久99| 可以在线观看的亚洲视频| 在线免费十八禁| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 韩国av在线不卡| 1024手机看黄色片| 春色校园在线视频观看| 久久午夜福利片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美zozozo另类| 制服丝袜大香蕉在线| 深爱激情五月婷婷| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲av.av天堂| 精品一区二区免费观看| 少妇丰满av| 午夜福利18| 午夜福利在线在线| 国产极品精品免费视频能看的| 在线天堂最新版资源| 动漫黄色视频在线观看| 国产视频一区二区在线看| 伦理电影大哥的女人| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品人妻久久久久久| 麻豆一二三区av精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 高清在线国产一区| 亚洲不卡免费看| 国产69精品久久久久777片| 国产成人aa在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲avbb在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久午夜亚洲精品久久| 日本一二三区视频观看| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 69av精品久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品久久视频播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日韩高清综合在线| 日韩高清综合在线| 毛片女人毛片| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 老司机福利观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲人成网站在线播| 国产久久久一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品国产三级普通话版| 精品一区二区免费观看| 香蕉av资源在线| 国产私拍福利视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 波多野结衣高清作品| 色哟哟·www| 乱人视频在线观看| 我要搜黄色片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 我要搜黄色片| 一区二区三区免费毛片| 99riav亚洲国产免费| 久久九九热精品免费| av女优亚洲男人天堂| 可以在线观看的亚洲视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩人妻高清精品专区| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 美女黄网站色视频| 变态另类丝袜制服| 极品教师在线免费播放| 成人午夜高清在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| www.www免费av| 国产淫片久久久久久久久| 国内精品久久久久久久电影| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲第一电影网av| 精品久久久噜噜| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线播放无遮挡| 内射极品少妇av片p| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品人妻少妇| 日韩欧美精品v在线| 黄片wwwwww| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕熟女人妻在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| a在线观看视频网站| 一进一出抽搐动态| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费黄网站久久成人精品| 男女那种视频在线观看| av专区在线播放| 不卡视频在线观看欧美| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品福利在线免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲自偷自拍三级| 偷拍熟女少妇极品色| 精品久久久久久久末码| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久性生活片| 老司机福利观看| av在线老鸭窝| 亚洲午夜理论影院| 精品福利观看| 国产三级中文精品| 无遮挡黄片免费观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲自偷自拍三级| 我要看日韩黄色一级片| 色播亚洲综合网| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国内精品久久久久精免费| 特级一级黄色大片| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 少妇丰满av| 精品久久久久久久久av| 免费观看人在逋| 午夜福利视频1000在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99久久成人亚洲精品观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av美国av| 一级毛片久久久久久久久女| 毛片女人毛片| 中出人妻视频一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品人妻少妇| 国产精品久久久久久精品电影| 色哟哟·www| 国产高清有码在线观看视频| 久久久色成人| 精品日产1卡2卡| 亚洲三级黄色毛片| 国产免费男女视频| 12—13女人毛片做爰片一| 一区福利在线观看| 床上黄色一级片| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲欧美日韩高清专用| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 丰满的人妻完整版| or卡值多少钱| 久久久色成人| 91麻豆av在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 麻豆成人av在线观看| 此物有八面人人有两片| 国产91精品成人一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 高清毛片免费观看视频网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品,欧美在线| 黄色视频,在线免费观看| 最后的刺客免费高清国语| 99热这里只有是精品在线观看| av黄色大香蕉| 欧美精品啪啪一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩强制内射视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| xxxwww97欧美| 亚洲在线观看片| 黄色一级大片看看| 波多野结衣高清无吗| 88av欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 51国产日韩欧美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 尾随美女入室| 九九在线视频观看精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲电影在线观看av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜老司机福利剧场| 91麻豆av在线| 18+在线观看网站| av在线蜜桃| 热99在线观看视频| 制服丝袜大香蕉在线| 最近在线观看免费完整版| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲性久久影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av免费在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 简卡轻食公司| 真实男女啪啪啪动态图| 伊人久久精品亚洲午夜| 此物有八面人人有两片| 国产成年人精品一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品456在线播放app | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| videossex国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 色综合婷婷激情| 两个人的视频大全免费| 久久精品国产清高在天天线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 不卡一级毛片| 精品国产三级普通话版| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线看三级毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av.av天堂| 夜夜爽天天搞| 如何舔出高潮| 搡老熟女国产l中国老女人| 波多野结衣高清无吗| 丰满乱子伦码专区| 熟女人妻精品中文字幕| 国产高清三级在线| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久国产成人免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| .国产精品久久| 五月伊人婷婷丁香| 观看美女的网站| xxxwww97欧美| 色综合婷婷激情| 在线观看av片永久免费下载| 天堂动漫精品| 亚洲最大成人手机在线| 九色国产91popny在线| 国产黄片美女视频| 在线观看一区二区三区| 一个人免费在线观看电影| 国产日本99.免费观看| 午夜日韩欧美国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚州av有码| 久久九九热精品免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| .国产精品久久| 亚洲美女视频黄频| 欧美成人a在线观看| 精品久久久久久成人av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费av观看视频| 午夜免费成人在线视频| 中文字幕熟女人妻在线| 99热6这里只有精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲最大成人av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利在线观看吧| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| h日本视频在线播放| 午夜a级毛片| 久久午夜福利片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线免费观看的www视频| 一本久久中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线天堂最新版资源| 精品午夜福利在线看| 精品一区二区三区视频在线| 联通29元200g的流量卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成年人精品一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 在线观看免费视频日本深夜| 97超视频在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 12—13女人毛片做爰片一| 有码 亚洲区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲内射少妇av| 日韩 亚洲 欧美在线| 18+在线观看网站| 国产精品福利在线免费观看| 国产黄色小视频在线观看| 久久草成人影院| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品一及| 久久久色成人| 中文字幕av在线有码专区| 日本与韩国留学比较| 欧美zozozo另类| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲一区二区三区色噜噜| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费在线观看成人毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 国产亚洲91精品色在线| 能在线免费观看的黄片| 国产亚洲精品av在线| 日本色播在线视频| 嫩草影院入口| 成人综合一区亚洲| 久久久午夜欧美精品| 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲国产色片| 赤兔流量卡办理| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩欧美免费精品| 九九爱精品视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 能在线免费观看的黄片| 欧美日本视频| 美女免费视频网站| 国产精华一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 日韩中字成人| 男人的好看免费观看在线视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产av在哪里看| 国产高清有码在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 日韩欧美 国产精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品,欧美在线| 人妻少妇偷人精品九色| 色综合婷婷激情| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品一区二区三区视频在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 91久久精品国产一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩综合久久久久久 | 高清毛片免费观看视频网站| a级一级毛片免费在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 午夜福利在线观看吧| 联通29元200g的流量卡| 国产 一区精品| 久久久久九九精品影院| av专区在线播放| 无遮挡黄片免费观看| www.www免费av| 少妇的逼水好多| 亚洲美女视频黄频| bbb黄色大片| 精品福利观看| 十八禁网站免费在线| 国产精品伦人一区二区| 99视频精品全部免费 在线| a级毛片a级免费在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 熟女电影av网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 91久久精品国产一区二区成人| 日日夜夜操网爽| 搡老岳熟女国产| 午夜精品在线福利| 亚洲最大成人中文| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜激情欧美在线| 黄色日韩在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 高清在线国产一区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲黑人精品在线| 窝窝影院91人妻| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲人与动物交配视频| 黄色一级大片看看| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久成人av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品野战在线观看| eeuss影院久久| 人妻少妇偷人精品九色| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品伦人一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日日干狠狠操夜夜爽| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 高清在线国产一区| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 九色国产91popny在线| 精品久久久久久,| 国产亚洲av嫩草精品影院| 尾随美女入室| 波多野结衣高清作品| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 亚洲精华国产精华精| 看黄色毛片网站| 精品乱码久久久久久99久播| x7x7x7水蜜桃| 在线天堂最新版资源| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产探花在线观看一区二区| 最新中文字幕久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费看美女性在线毛片视频| 午夜精品一区二区三区免费看| avwww免费| 久久久久性生活片| 不卡一级毛片| 日本 欧美在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕免费在线视频6| 日韩精品青青久久久久久| 日韩高清综合在线| 色5月婷婷丁香| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲色图av天堂| 中文字幕熟女人妻在线| 国内精品久久久久精免费| 亚洲美女视频黄频| 成年免费大片在线观看| 不卡一级毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品亚洲美女久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 精品久久久久久久久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜爱爱视频在线播放| 女同久久另类99精品国产91| av视频在线观看入口| 中文字幕高清在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美色视频一区免费| 久久香蕉精品热| 欧美激情在线99| 搞女人的毛片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 真实男女啪啪啪动态图| 在线观看一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 舔av片在线| 可以在线观看毛片的网站| 88av欧美| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 少妇丰满av| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久6这里有精品| 特级一级黄色大片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄色欧美视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品综合久久久久久久免费| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲经典国产精华液单| 两个人视频免费观看高清| 在线播放无遮挡| 露出奶头的视频| 赤兔流量卡办理| 有码 亚洲区| 精品久久久噜噜| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 在线看三级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| av女优亚洲男人天堂| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩欧美精品免费久久| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 一本久久中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av在线亚洲专区| 深爱激情五月婷婷| 色综合婷婷激情| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 日本一二三区视频观看| 国产高清不卡午夜福利| 97热精品久久久久久| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品久久视频播放| av福利片在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品国产高清国产av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国内精品一区二区在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久久久中文| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品嫩草影院av在线观看 | 午夜a级毛片| 人妻久久中文字幕网| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品国产三级普通话版| 亚洲美女搞黄在线观看 | 少妇人妻一区二区三区视频| 久久草成人影院| 一a级毛片在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲av熟女| 精品福利观看| 日韩高清综合在线| 国产午夜福利久久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 成人毛片a级毛片在线播放| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲人与动物交配视频| 精品人妻1区二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费黄网站久久成人精品| 免费av毛片视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品影院6| 麻豆一二三区av精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 亚洲av免费高清在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人av教育| 久久人人精品亚洲av| 午夜福利成人在线免费观看| www日本黄色视频网|