鍍鎳多壁碳納米管對序批式反應(yīng)器性能及其微生物群落的影響?

高 峰， 馬丙瑞， 李姍姍， 于娜玲， 趙長坤， 李志偉， 高孟春??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100)

多壁碳納米管(Multi-walled Carbon Nanotubes，簡稱MWCNTs)因其獨(dú)特的一維納米結(jié)構(gòu)以及優(yōu)良的力學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性能，被廣泛地應(yīng)用于材料工業(yè)、電子工業(yè)、環(huán)保及能源工業(yè)、生物醫(yī)藥和催化劑等領(lǐng)域[1-3]。MWCNTs的廣泛應(yīng)用，不可避免地會在生產(chǎn)、使用和廢棄過程中釋放到環(huán)境中去，從而增加了人、動物和植物與MWCNTs的接觸機(jī)會，其潛在的環(huán)境效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。大量關(guān)于MWCNTs毒理學(xué)的研究結(jié)果表明[4-7]，MWCNTs能穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入生命體，進(jìn)而對人體器官、動物、植物和微生物等產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。進(jìn)入環(huán)境中的MWCNTs可通過在土壤、水和空氣等環(huán)境介質(zhì)中遷移而進(jìn)入水環(huán)境，最終出現(xiàn)在污水生物處理系統(tǒng)中。Gottschalk等[8-9]模擬了CNTs在污水和污泥中的濃度，預(yù)測其濃度在μg/L水平上。同時隨著MWCNTs的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，不可避免地會通過各種途徑被釋放到環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致環(huán)境中的MWCNTs濃度不斷升高。

鑒于MWCNTs具有較強(qiáng)的生態(tài)毒性效應(yīng)，隨著活性污泥中富集的MWCNTs不斷增加，可能會對活性污泥中的微生物活性及其群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其對污水中有機(jī)物、氮和磷等的去除效果。Luongo和Zhang[10]報(bào)道了MWCNTs能夠抑制活性污泥的呼吸活性，且抑制作用呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。Zheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，0～100 mg/L MWCNTs的短期暴露對序批式反應(yīng)器(Sequencing Batch Reactor，簡稱SBR)的脫氮除磷性能和活性污泥中的微生物活性無明顯影響。Hai等[12]發(fā)現(xiàn)1和20 mg/L MWCNTs的短期暴露未對SBR的脫氮除磷性能產(chǎn)生影響，然而20 mg/L MWCNTs的長期作用明顯抑制了SBR對COD、氮和磷的去除效果。

鍍鎳碳納米管(Ni coated multi-walled carbon nanotubes，簡稱MWCNTs-Ni)是指將原始MWCNTs進(jìn)行純化、敏化和活化預(yù)處理，然后利用化學(xué)鍍鎳的方法在其表面沉積一層金屬鎳而制備出的功能化多壁碳納米管[13]。相較于原始MWCNTs，MWCNTs-Ni在分散性、抗蝕性、電磁性能及微波吸收性能等方面均得到改善，從而大大拓寬了MWCNTs在各領(lǐng)域中的應(yīng)用[13-14]。高的分散性使得MWCNTs-Ni更易于分散在水環(huán)境中，并通過遷移轉(zhuǎn)化最終出現(xiàn)在污水生物處理系統(tǒng)中。然而，關(guān)于長期暴露條件下MWCNTs-Ni對污水生物處理系統(tǒng)性能及其微生物群落影響的研究未見報(bào)道。根據(jù)以往的研究報(bào)道[10-12]，本研究選用MWCNTs-Ni濃度為10 mg/L，研究了了長期暴露條件下MWCNTs-Ni對SBR性能、微生物酶活性和微生物群落的影響；通過活性氧(Reactive oxygen species，簡稱ROS)產(chǎn)生量和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，簡稱LDH)釋放量的變化情況評價了MWCNTs-Ni的長期暴露對活性污泥的生物毒性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行條件

SBR實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。反應(yīng)器采用有機(jī)玻璃材質(zhì)，有效高度為50 cm，內(nèi)徑為14 cm，有效容積為7.7 L。通過蠕動泵從SBR底部進(jìn)水，在反應(yīng)器中部設(shè)置出水閥，通過電磁閥控制排水，容積交換率為50%。SBR每日運(yùn)行3個周期，每個周期8 h，通過時間繼電器進(jìn)行自動調(diào)控，具體運(yùn)行參數(shù)如下：進(jìn)水階段0.1 h，缺氧階段2.8 h，好氧階段3 h，沉淀階段0.5 h，排水階段0.1 h，閑置階段1.5 h。除了沉淀、排水和閑置階段，磁力攪拌器一直運(yùn)行，確保污泥和污水充分混合。SBR采用底部曝氣方式，空氣壓縮機(jī)通過砂芯曝氣頭從反應(yīng)器底部通入空氣，并使用氣體轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)曝氣量，維持好氧階段的溶解氧在2 mg/L以上。在好氧階段結(jié)束前，排出一定量的污泥，保證系統(tǒng)的除磷效果，同時使污泥齡保持在20 d左右。

1.2 接種污泥和進(jìn)水水質(zhì)

圖1 SBR示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SBR

1.3 MWCNTs-Ni儲備液配制

本試驗(yàn)所用的MWCNTs-Ni購于中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，具體參數(shù)如下：純度>98%，長度50 μm，內(nèi)徑3～5 nm，外徑8～15 nm。MWCNTs-Ni儲備液的配制方法如下[15]：稱取0.5 g MWCNTs-Ni粉末，干燥滅菌后在超凈臺中冷卻，加入1 L經(jīng)0.22 μm濾膜滅菌的Milli-Q水，用磁力攪拌器攪拌30 min后超聲1 h(25 ℃，250 W，40 kHz)，隨后在25 ℃，150 r·min-1的條件下放置1夜。在每次配制進(jìn)水前，先將儲備液超聲1 h以打碎MWCNTs-Ni聚集體。

1.4 分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNTs-Ni對SBR性能的影響

圖2 MWCNTs-Ni對SBR去除性能的影響Fig. 2 Effects of MWCNTs-Ni on the SBR performance

2.2 MWCNTs-Ni對活性污泥SOUR和脫氮速率的影響

2.3 MWCNTs-Ni對活性污泥中酶活性的影響

DHA在有機(jī)物降解過程中起關(guān)鍵作用[18]，長期暴露條件下MWCNTs-Ni對活性污泥中DHA活性的影響如圖4所示。與進(jìn)水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥中DHA活性在第71天時未發(fā)生明顯變化，而隨著SBR繼續(xù)運(yùn)行至第148天，DHA由第32天時的(15.26±0.57) mg TF/(g MLVSS·h)降至(11.55±0.57) mg TF/(g MLVSS·h)，降低了24.32%(p<0.05)，表明MWCNTs-Ni的長期暴露能夠抑制SBR活性污泥中DHA活性。

(“*”表示該樣品與進(jìn)水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L時的SOUR和脫氮速率差異性顯著(p<0.05). Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from SOUR and nitrogen removal rates at 0 mg/L MWCNTs-Ni.)

圖3 MWCNTs-Ni對活性污泥SOUR和脫氮速率的影響
Fig. 3 Effects of MWCNTs-Ni on the SOUR and nitrogen removal rates of activated sludge

(“*”表示該樣品與進(jìn)水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L時的微生物酶活性差異性顯著(p<0.05)。 Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial enzymatic activity at 0 mg/L MWCNTs-Ni.)

圖4 MWCNTs-Ni對微生物酶活性的影響
Fig. 4 Effects of MWCNTs-Ni on the microbial enzymatic activity of activated sludge

2.4 MWCNTs-Ni對活性污泥的生物毒性影響

ROS的產(chǎn)生量和LDH的釋放量是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定活性污泥ROS的產(chǎn)生量和LDH的釋放量來評價MWCNTs-Ni的長期暴露對活性污泥的生物毒性影響。如圖5所示，與進(jìn)水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥ROS產(chǎn)生量在第71天、108天和148天時分別增加了24.66%、47.53%和67.23%。上述研究結(jié)果表明，MWCNTs-Ni(“*”表示該樣品與進(jìn)水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L的樣品差異性顯著(p<0.05)。 Asterisks indicate statistical differences (p<0.05) from the ROS production and LDH release at 0 mg/L MWCNTs-Ni)的長期暴露能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，過量的ROS會打破細(xì)胞氧化過程及抗氧化過程的平衡，從而對活性污泥中的微生物造成氧化性損傷[20-21]?；钚晕勰郘DH的釋放量隨SBR運(yùn)行時間的延長而逐漸增加，與進(jìn)水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，LDH的釋放量在第148天時增加了65.33%，表明MWCNTs-Ni能夠誘導(dǎo)活性污泥中微生物產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞膜損傷。

圖5 MWCNTs-Ni對活性污泥ROS相對產(chǎn)生量和LDH相對釋放量的影響Fig. 5 Effect of MWCNTs-Ni on the relative ROSproduction and LDH release of activated sludge

2.5 MWCNTs-Ni對活性污泥中微生物群落的影響

表1表示不同運(yùn)行時間條件下微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)。在第32、71、108和148天時，將測序得到的有效序列以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類分析，分別獲得645、634、584和527個OTUs。SBR中活性污泥樣品的Good’s coverage在第32、71、108和148天時為0.999，表明測序結(jié)果涵蓋了樣品中絕大部分物種，能夠準(zhǔn)確地反映微生物群落豐富度和多樣性。Chao1和ACE指數(shù)能夠表征微生物群落的豐富度，而Shannon和Simpson指數(shù)能夠表征微生物群落的多樣性[22]。Chao1和ACE指數(shù)值越大，說明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。隨著SBR由第32天運(yùn)行至第148天，Chao1和ACE指數(shù)分別從643.7和652.3降至516.6和521.2，Shannon和Simpson指數(shù)分別從6.914和0.973降至5.436和0.887，表明MWCNTs-Ni的長期暴露降低了SBR中微生物群落的豐富度和多樣性。

表1 不同運(yùn)行時間條件下微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)Table 1 Richness and diversity indices of microbial community at different operation times

圖6表示不同運(yùn)行時間條件下微生物群落在門和屬水平上的分類。在進(jìn)水中未加入MWCNTs-Ni的第32天，活性污泥微生物群落中豐度最大的菌門Proteobacteria，占總?cè)郝涞?0.91%；其次為Bacteroidetes，占總?cè)郝涞?8.35%。隨著SBR逐漸運(yùn)行至第148天，Bacteroidetes的相對豐度逐漸增至49.17%，顯示出較好的MWCNTs-Ni耐受能力；而Proteobacteria的相對豐度逐漸降至33.71%。Proteobacteria中包含許多與脫氮除磷過程相關(guān)的菌屬，在氮、磷的去除過程中發(fā)揮著重要作用，Proteobacteria相對豐度的降低可能是SBR對氮去除效果降低的原因。此外，Chloroflexi、Ignavibacteriae、Chlorobi、Acidobacteria、Planctomycetes((a)門水平；(b)屬水平(a) phyla level and (b) genus levels.) 和Actinobacteria等菌門的相對豐度也隨MWCNTs-Ni暴露時間的延長而呈降低趨勢。當(dāng)SBR運(yùn)行至第148天時，亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas、亞硝化螺菌屬Nitrosospira和硝化螺菌屬Nitrospira的相對豐度分別由未加入MWCNTs-Ni時的1.19%、0.27%和0.59%降至0.24%、0.09%和0.25%。在污水處理過程中，Nitrosomonas和Nitrosospira是兩種主要的氨氧化細(xì)菌，能夠?qū)钡趸蓙喯醯猍23]；而Nitrospira是一種主要的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，能夠?qū)喯醯趸上醯猍24]。在不同時間條件下的4個污泥樣品中共觀察到5種反硝化菌屬：Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas，它們能夠在好氧或者厭氧條件下還原硝氮或者亞硝氮[25-29]。當(dāng)SBR運(yùn)行至第148天時，Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas的相對豐度分別從第32天時的3.46%、1.84%、0.71%、0.39%和0.39%降至0.71%、0.25%、0.22%、0.19%和0.11%。上述結(jié)果表明，MWCNTs-Ni的長期暴露明顯降低了活性污泥中與硝化過程及反硝化過程相關(guān)的微生物群落的相對豐度，進(jìn)而影響到SBR對氮的去除。隨著SBR由第32天運(yùn)行至第148天，F(xiàn)lexibacter、Sediminibacterium、Ignavibacterium、Levilinea、Terrimonas、Methylosinus、Planctomyces和Flavobacterium等菌屬的相對豐度逐漸降低；而Candidatus_Competibacter、Haliscomenobacter、Anaerolinea、Owenweeksia和Lewinella的相對豐度分別從17.33%、9.77%、1.35%、0.43%和0.15%增至23.19%、33.62%、2.14%、2.26%和3.97%，表明MWCNTs-Ni的長期暴露使得活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

((a)門水平；(b)屬水平。(a) Phyla level; (b) Genus levels.)

3 結(jié)論

(2)與進(jìn)水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥SOUR和DHA活性在第148天時分別降低了17.43%和24.32%；而脫氮速率和與脫氮相關(guān)的微生物酶活性均降低了60%以上，從而導(dǎo)致SBR對氮的去除效果明顯降低。

(3)MWCNTs-Ni的長期暴露導(dǎo)致活性污泥ROS產(chǎn)生量和LDH釋放量在第148 天時分別增加了67.23%和65.33%，表明MWCNTs-Ni的長期暴露能夠誘導(dǎo)活性污泥中微生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞膜損傷。

(4)高通量測序結(jié)果表明長期暴露于10 mg/L的MWCNTs-Ni條件下，活性污泥中與硝化過程相關(guān)菌屬和與反硝化過程相關(guān)菌屬的相對豐度明顯降低，進(jìn)而影響到SBR對氮的去除。