聚酰胺胺樹形化合物基因載體的研究進展

王 翔，郭良君，孔飛飛，高 申

（1.解放軍第98醫(yī)院藥械科，浙江湖州313000；2.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海200433）

聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM）樹形化合物是一種高度分枝輻射狀對稱的球形新型高分子聚合物，由美國化學家Tomalia等人于1985年首次合成。1993年，Haensler和Szoka首次嘗試將PAMAM作為非病毒載體用于體外基因轉染，它的高度分枝化、球體結構、外表面多價電荷分布、分子內部大量空腔、單分散性、高度可溶性使其具備獨特的性質和特點。相對于其他陽離子聚合物，PAMAM的體積大小、分子質量、分枝數(shù)目、表面末端基團密度及種類都是專一可控的。根據(jù)不同的用途，可獲得結構精細、規(guī)整，大小和表面功能確切的樹形分子，它內部具有大量空腔，可以攜帶更多的藥物。另外，PAMAM是非生物材料，無免疫原性和遺傳毒性，在正常生理條件下，分子表面的末端基團氨基呈弱堿性而帶有正電荷，因此它可以與天然狀態(tài)下一切帶有負電的生物分子結合，在藥物遞送、基因轉染、疾病診斷、影像顯影等領域有很廣泛的應用。

1 PAMAM－DNA復合物的傳導過程

PAMAM與DNA的結合與其他陽離子化合物一樣，主要是通過電荷作用。表面帶正電荷的樹形化合物（dendrimer）與核苷酸分子中帶負電的磷酸根靜電作用結合，DNA會因化合物的合成代數(shù)和電荷比的不同而被不同程度地壓縮，進而自我組裝成樹形化合物－核酸分子復合物。這一過程只改變DNA的二級結構，并不引起其一級結構的改變，也是介導遺傳物質轉移的起始步驟與關鍵性參數(shù)。DNA納米粒子被哺乳動物細胞攝取的大致過程如下［1］：DNA被陽離子化合物縮合形成規(guī)則的納米結構，如球形、環(huán)形和柱形結構等，到達靶細胞后，納米粒子與靶細胞表面的陰離子蛋白聚糖等相互作用，通過內吞入胞等方式被轉運至細胞內。陽離子物質在酸性的吞噬囊泡內聚集，增加內吞泡的pH值，從而抑制DNA被溶酶體酶降解，它們還可引起質子的內流，使內吞泡失去穩(wěn)定，使DNA被釋放到細胞質中，DNA于是通過核孔或在核定位信號介導下進入細胞核，并離開陽離子載體解縮合而復原成生物活性的DNA，進而發(fā)揮效應。有報道認為，當兩者正負電荷比（N／P）＜1時，由于壓縮的程度較低，對DNA的保護作用是不完全的，電鏡下觀察到，大多數(shù)質粒DNA被壓縮成孤立的環(huán)狀分子，但是仍可見大而不規(guī)則的復合物沉淀［2］。另外，樹形化合物與DNA復合物的形成還受到DNA濃度、樹形化合物分子及核苷酸分子大小的影響。當PAMAM－DNA復合物N／P＞1時，復合物表面呈凈正電性，可以與細胞膜表面帶有負電的糖蛋白和磷脂靜電結合，經(jīng)液相內吞作用入胞形成內涵體。由于聚合物表面氨基的弱堿性可使內涵體內pH升高，利于復合物從內涵體中脫離而釋放到細胞質內。被溶酶體融合的復合物，必須在被溶酶體酶降解之前“逃離”才能發(fā)揮作用。在溶酶體強酸性環(huán)境中，復合物內部的叔胺基團高度質子化而使得大量氯離子內流，造成溶酶體滲透性腫脹，最終破裂而將復合物釋放，這就是溶酶體的“質子海綿效應（proton sponge effect）”［3］。釋放到細胞質中的復合物約30min后進入細胞核，具體機制尚不清楚，目前有兩種可能：（1）帶正電的PAMAM－DNA復合物與帶負電的磷脂膜結合而被包被；（2）內涵體破裂時復合物仍與內涵體磷脂膜緊貼在一起，隨后磷脂膜與核膜融合，把復合物釋放入細胞核內。與脂質體相比，PAMAM載DNA或者質粒DNA更穩(wěn)定，效率更高。這一方面源于PAMAM的結構，更主要源于表面氨基較低的pKa值（3.9～6.9），使其在溶酶體中可以緩沖較大的pH值變化而不被降解。

2 PAMAM的毒性以及轉染效率

高效、低毒的基因載體是基因治療進入臨床使用的必要條件，因此高效率和低毒性也就成為開發(fā)新的基因載體的目標?；蜉d體的效率可用細胞轉染率及編碼外源蛋白質的表達量來表示，它與載體能否有效地保護外源基因免于水解酶的破壞，并促進其突破各種生物膜屏障進入細胞核等適于基因表達的細胞器內有關?；蜉d體的毒性根據(jù)聚合物的侵害對象可分為細胞毒性、血液毒性和組織毒性，其中細胞毒性是體外基因轉染時評價基因載體的一個重要指標。

PAMAM的毒性受表面特征的影響，表面帶正電基團的PAMAM分子很容易破壞細胞膜，引起膜破裂，由此造成的細胞毒性呈濃度和合成代數(shù)依賴性［4］。目前國際上對于納米粒子性質的描述和其安全性的評估實驗系統(tǒng)沒有形成統(tǒng)一規(guī)范化的標準。Kukowska－Latallo等［5］用20種不同的PAMAM裝載兩種不同的報告基因，在不同的pH值、不同的N／P值和外加試劑的條件下，分別轉染了18種真核細胞，發(fā)現(xiàn)合成第3代～第10代（G3～G10）PAMAM可以在生理條件下與DNA形成穩(wěn)定的復合物。G5～G10PAMAM由于表面氨基基團和自身球形結構可以同時與磷脂膜和DNA結合而實現(xiàn)基因轉染，對細胞的毒性呈聚合物濃度和合成代數(shù)依賴性，并且與細胞類型有關。Hill等［6］檢測了一系列PAMAM樹狀物的細胞毒性，并與聚賴氨酸作比較。結果表明，大多數(shù)PAMAM分子對HepG2及HL－60細胞株無毒副作用，但其中NG30（核心分子為亞甲二丙烯酰胺及二甲基乙烯二胺）與聚賴氨酸有相似的毒性；而以二丙烯哌嗪及2－甲基哌嗪為共核心分子的NG37、NG38、NG39對上述兩種細胞株有輕度毒性。Malik等［7］檢測了一組樹狀物的體外毒性，包括PAMAM（Starburst）、聚氧乙烯和硅烷的接枝共聚物（CSi－PEO）和聚丙稀亞胺樹狀物（DAB－dendrimer或DAE－dendrimer）。結果發(fā)現(xiàn)，以氨基為端基的樹狀物的溶血毒性依賴于合成代數(shù)和樹狀物的濃度，CSi－PEO和以－COONa為端基的樹狀物既沒有溶血毒性也沒有細胞毒性。研究還發(fā)現(xiàn)，高代的PAMAM由于固有的毒性，不適合注射給藥。對同一類樹狀物而言，樹狀物載體的毒性隨著分子質量的增大而增大。以上研究表明，樹狀物載體的細胞毒性與自身結構關系密切。Thomas等［8］用乙酰化方法獲得表面氨基覆蓋率不同的G5 PAMAM聚合物，經(jīng)熒光標記后轉染KB細胞（HeLa細胞的一個亞系），發(fā)現(xiàn)將40%的氨基乙?；瘯r，開始逐漸顯示出毒性，表明氨基介導細胞毒性的高度相關性。Parimi等［9］研究PAMAM濃度、合成代數(shù)與其內吞作用和毒性的關系，分別轉染了HEK293T細胞和HeLa細胞后發(fā)現(xiàn)，聚合物對細胞促進和抑制的作用轉折點濃度為500nmol／L，當濃度為700nmol／L時，細胞呈現(xiàn)負增長，確定了500～700nmol／L這個高效、低毒的轉染濃度窗。此外，他們巧妙地設計了脂質體泄漏實驗，模擬細胞被聚合物侵襲形成微孔最終崩解的過程，定性分析了聚合物對細胞的覆蓋率與毒性的大小呈濃度與合成代數(shù)的依賴性?？傮w來說，陽離子聚合物的毒性大于陰離子聚合物，線性聚合物的毒性大于樹形聚合物，表面端基的種類也很重要，氨基的毒性大于羧基或羥基，伯胺的毒性大于叔胺和仲胺［3］。

陽離子聚合物載體和陽離子脂質體的轉染機制相似，兩者轉基因的效率主要與載體的組成、載體與DNA的N／P、轉染組織或細胞類型、DNA進入細胞質或細胞核的效率，以及陽離子聚合物的穩(wěn)定性有關。盡管不同的研究者對N／P這一比例的確定數(shù)值看法不盡相同，但普遍認為應＞1。載體的比例越高，轉染效率就越高，而細胞毒性也隨之增大。因此，陽離子載體與基因的用量比例合適才能獲得最佳的轉染條件。DNA復合物帶有過量正電荷對轉染很關鍵，可增強與帶負電荷的細胞膜的結合力，使進入細胞的復合物的量增加。而且由于血清蛋白帶負電荷，可與陽離子脂質結合使DNA從復合物中分離出來而使之降解，也可造成復合體凝聚，通過網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)排出，而過量的正電荷可以減小或消除這些影響。在體內的轉染研究發(fā)現(xiàn)，PAMAM在腎臟中表達水平最高，在肝、肺、脾中也有高表達，在心、腦、胃、腸中表達水平較低［10］。但是到目前為止，PAMAM在體內的代謝過程和具體分布尚不清楚。另外，陽離子載體－DNA復合物的穩(wěn)定性也會影響基因的轉染效率。穩(wěn)定性越好，基因進入細胞質和細胞核的效率越高，則轉染效率也越高。

3 PAMAM作為基因載體的優(yōu)化

雖然相比于裸基因或其他非病毒型基因載體，如脂質體、聚乳酸等，PAMAM介導的細胞轉染效率都較高，但是為了得到高效、低毒，適合基因遞送的載體，常常以不同方式優(yōu)化PAMAM，通過改變自身的性質以適應基因遞送的需求。

3.1 N／P值和合成代數(shù)的大小 不同實驗室運用的PAMAM種類、細胞類型以及實驗條件的差異，摸索出的體外最優(yōu)轉染條件也不完全一致。Santos等［11］用G5、G6、G7三代PAMAM在不同N／P下轉染間質干細胞，總結出G5和G6PAMAM在N／P為10時的轉染效率最高。Zhou等［12］用G7PAMAM裝載siRNA，在N／P為1∶10～20∶1時轉染A549Luc細胞。結果表明，G7PAMAM N／P在該范圍可獲得明顯的基因沉默效應。Braun等［13］用G2、G4、G7、G9PAMAM－DNA在不同N／P（1～5、10）時轉染倉鼠卵巢細胞CHO－K1。結果在N／P為5時，所有PAMAM－DNA的粒徑均達最小且轉染效率明顯提高，以G4PAMAM提高幅度最大。

3.2 熱降解 用加熱的方法降解PAMAM分子，使其嚴格規(guī)整的結構分散開來，增加了其轉染靈活性，有利于其與DNA更緊密結合，在釋放DNA時更易于膨脹，轉染效率明顯提高。熱降解是一個隨機的激活過程，通過對PAMAM水溶液加熱不同的時間，形成了在分子質量和結構上有細微差別的混合組分。隨著加熱時間的延長、N／P的增大，PAMAM－DNA分子粒徑逐漸減小，而對完整PAMAM則無明顯變化。Navarro等［14］對G4和 G5PAMAM在HepG2細胞中進行的轉染實驗表明，通過加熱的方式活化聚合物，在N／P為6，活化時間為24h時，G5PMAMA的轉染效率最高，顯著高于未活化的聚合物。目前，已商品化的樹狀大分子基因載體Superfect就是經(jīng)降解的PAMAM分子。

3.3 納米載體的修飾 對樹形分子末端進行表面修飾可以改變其化學屬性，影響其物理性質，如電荷、親水性、溶解度等，也是目前研究最為廣泛的對陽離子聚合物載體的優(yōu)化方式。Qi等［15］報道以G5、G6PAMAM為對照，用4%、8%、15%（PEG結合PAMAM表面氨基的摩爾比）PEG－PAMAM G5、PEG－PAMAM G6載報告基因，經(jīng)肌內注射后轉染肌細胞，與同代的PAMAM 相比，8%的PEG－PAMAM介導的報告基因表達水平最高，隨著摩爾比的增加，細胞相對存活率也增加，且與濃度呈負相關。PEG－PAMAM表面連接上狂犬病毒糖蛋白（RVG29）作為配體，形成PAMAM－PEG－RVG29／DNA復合物并在新生小鼠上進行實驗。結果發(fā)現(xiàn)其在大腦中有明顯的高表達，這可能與大腦屏障中豐富的GABAB受體有關［16］。除此之外，還有學者在PAMAM表面連接乳鐵蛋白、葉酸等做配體，同樣達到靶向轉染的目的。Nam等［17］將精氨酸分別連接到G2、G3、G4PAMAM上，與DNA形成新的復合物e－PAMAM，并與未修飾的PAMAM做了比較，發(fā)現(xiàn)在HUVEC細胞中，e－PAMAM G4的毒性和轉染效果都較未修飾前提高。在以羥基為末端的PAMAM表面連接精氨酸，可以有效緩沖溶酶體內的酸堿度變化，有利于DNA由溶酶體釋放入細胞質，進而進入細胞核參與核內反應［18，19］。此外，Deng等［20］用環(huán)糊精修飾過的PAMAM在成纖維細胞中轉染siRNA，發(fā)現(xiàn)轉染效率明顯提高，而且毒性顯著降低，同時修飾上去的環(huán)糊精還可以起到攜帶疏水性藥物如抗癌藥的作用。Wu等［21］用PEG化的PAMAM連接具有前列腺癌靶向的RNA適體A10，與miRNA－15a和miRNA－16－1形成復合物。細胞轉染實驗表明，復合物具有較好的前列腺靶向作用。Yu等［22］用五乙烯六胺（pentaethylenehexamine，PEHA）修飾PAMAM，然后連接PEG，形成PEG－PAMAM－PEHA聚合物，最后在PEG的一端連接表皮生長因子（EGF），通過肝癌細胞HuH－7轉染實驗證實，復合物轉染pDNA效率為未連接EGF的復合物的10倍，為腫瘤的治療提供了新的思路。

3.4 其他 在PAMAM－DNA體系中加入一些試劑可以提高轉染效率。氯喹呈弱堿性，在復合物或培養(yǎng)介質中加入氯喹，經(jīng)細胞攝取后能升高核內體的pH值，從而抑制核內體－溶酶體之間的融合，有助于復合物從核內體中脫離出來，避免了DNA被核酸酶降解，從而有效提高了轉染的效率［23］。此外，由于核內體中的pH值約為5.5，PAMAM在pH 5～7具有極強的緩沖能力，因而也具有較高的轉染效率［24］。這是由于高緩沖能力的陽離子載體隨著核內體的酸化而使內部叔氨基質子化，可作為弱堿基對而顯示出抗核內體酸化的作用，復合物正電荷密度增高，部分原來為了維持電荷平衡而與DNA結合的載體從復合物中解離出來，導致核內體腫脹和滲透壓的升高，核內體膜更容易破裂，有助于復合物的逃逸。高合成代的PAMAM分子由于表面電荷密度過大易于聚集，影響轉染效率，而分散劑二乙氨乙基葡萄糖的加入則可以中和部分電荷，使聚集體得到分散，從而提高轉染效率［7］。

4 展 望

自1990年世界上第一例利用基因療法治療人類疾病的臨床試驗開始，至今基因治療已有20多年。在這20多年中，基因治療的技術和方法都有了極大的改進，應用的范圍也從一開始的遺傳性疾病到現(xiàn)在的腫瘤、感染性疾病以及退行性疾病等。為了使目的基因或攜帶目的基因的載體能高效特異地轉導入靶細胞，減少基因載體復合物在體內與非靶向物質的結合，提高目的基因在靶細胞中的聚集濃度，人們在載體表面連接一些靶向分子，實現(xiàn)了基因的靶向轉染。

近年來，RNA干擾和反義RNA的轉錄抑制技術作為兩種有力的基因滅活技術，在許多疾病的臨床治療方面有所發(fā)展，特別是在腫瘤治療中，常用于抑制或封閉某些癌基因的表達。有學者用PAMAM載熱休克蛋白27（Hsp27）siRNA介導對前列腺癌細胞系的轉染，有效封閉了Hsp27基因的表達，抑制了癌細胞生長并有效誘導其凋亡，為前列腺癌的基因治療尋求到一種新的方法［25］。與此同時，Ren等［26］利用反義技術將反義miRNA－21（人腦膠質瘤抗凋亡因子）和氟尿嘧啶用PAMAM遞送到膠質母細胞瘤細胞中，這種共轉染不僅有效抑制了人腦膠質瘤抗凋亡因子的表達，而且提高了化療藥物的藥效，增加腫瘤細胞的凋亡并抑制其遷移能力。介于此種技術效率高、針對性強的特點，目前基因滅活療法已逐漸成為癌癥治療中最有潛力也是最活躍的研究方向。另外，基于樹形化合物獨特的三維結構、多分散性、表面活性基團和模擬功能，藥物分子可被封裝載入到聚合物內部，也可通過靜電作用或共價鍵被吸附到表面，這大大提高了藥物裝載量和投遞率。因此，PAMAM目前已用于多種腫瘤化療藥物的遞送系統(tǒng)研究中。此外，PAMAM介導藥物運輸還可以增加藥物的溶解性和滲透性，并延長藥物在細胞內的滯留時間［27］。針對PAMAM大分子的特點，可用它攜帶某些小分子藥物。研究者發(fā)現(xiàn)這類復合體很難進入胎盤屏障，特別是當藥物半衰期相對較短時，效果更加明顯，這一研究也為孕婦的疾病治療開辟了新的思路［28］。

作為非病毒基因載體，PAMAM還存在一些尚待解決的問題，如由于高分子的降解速率慢而帶來的相對高毒性、DNA轉染至細胞核內的障礙等。然而，隨著人們對PAMAM基因載體的設計和完善，PAMAM基因載體必將在基因治療中發(fā)揮舉足輕重的作用。

［1］ Vijayanathan V，Thomas T，Thomas T J.DNA nanoparticles and development of DNA delivery vehicles for gene therapy［J］.Biochemistry，2002，41（48）：14085－14094.

［2］ Bielinska A U，Kukowska－Latallo J F，Baker J R Jr.The interaction of plasmid DNA with polyamidoamine dendrimers：mechanism of complex formation and analysis of alterations induced in nuclease sensitivity and transcriptional activity of the complexed DNA［J］.Biochim Biophys Acta，1997，1353（2）：180－190.

［3］ Lin Chao，Engbersen J F J.Effect of chemical functionalities in poly（amido amine）s for non－viral gene transfection［J］.J Control Release，2008，132（3）：267－272.

［4］ Svenson S，Tomalia D A.Dendrimers in biomedical applications－reflections on the field［J］.Adv Drug Deliv Rev，2005，57（15）：2106－2129.

［5］ Kukowska－Latallo J F，Bielinska A U，Johnson J，et al.Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（10）：4897－4902.

［6］ Hill I R C，Garnett M C，Bignotti F，et al.In vitro cytotoxicity of poly（amidoamine）s：relevance to DNA delivery［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1427（2）：161－174.

［7］ Malik N，Wiwattanapatapee R，Klopsch R，et al.Dendrimers：relationship between structure and biocompatibility in vitro，and preliminary studies on the biodistribution of125I－labelled polyamidoamine dendrimers in vivo［J］.J Control Release，2000，65（1－2）：133－148.

［8］ Thomas T P，Majoros I，Kotlyar A，et al.Cationic poly（amidoamine）dendrimer induces lysosomal apoptotic pathway at therapeutically relevant concentrations［J］.Biomacromolecules，2009，10（12）：3207－3214.

［9］ Parimi S，Barnes T J，Callen D F，et al.Mechanistic insight into cell growth，internalization，and cytotoxicity of PAMAM dendrimers［J］.Biomacromolecules，2010，11（2）：382－389.

［10］ Zhong Hui，He ZhiGuo，Li Zheng，et al.Studies on polyamidoamine dendrimers as efficient gene delivery vector［J］.J Biomater Appl，2008，22（6）：527－544.

［11］ Santos J L，Oramas E，Pêgo A P，et al.Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells using PAMAM dendrimers as gene delivery vectors［J］.J Control Release，2009，134（1）：141－148.

［12］ Zhou JieHua，Wu JiangYu，Hafdi N，et al.PAMAM dendrimers for efficient siRNA delivery and potent gene silencing［J］.Chem Commun（Camb），2006，14（22）：2362－2364.

［13］ Braun C S，Vetro J A，Tomalia D A，et al.Structure／function relationships of polyamidoamine／DNA dendrimers as gene delivery vehicles［J］.J Pharm Sci，2005，94（2）：423－436.

［14］ Navarro G，de ILarduya C T.Activated and non－activated PAMAM dendrimers for gene delivery in vitro and in vivo［J］.Nanomedicine，2009，5（3）：287－297.

［15］ Qi Rong，Gao Yu，Tang Yin，et al.PEG－conjugated PAMAM dendrimers mediate efficient intramuscular gene expression［J］.AAPS J，2009，11（3）：395－405.

［16］ Liu Yang，Huang RongQin，Han Liang，et al.Brain－targeting gene delivery and cellular internalization mechanisms for modified rabies virus glycoprotein RVG29nanoparticles［J］.Biomaterials，2009，30（25）：4195－4202.

［17］ Nam H Y，Hahn H J，Nam K，et al.Evaluation of generations 2，3and 4arginine modified PAMAM dendrimers for gene delivery［J］.Int J Pharm，2008，363（1－2）：199－205.

［18］ Kim T I，Bai ChengZhe，Nam K，et al.Comparison between arginine conjugated PAMAM dendrimers with structural diversity for gene delivery systems［J］.J Control Release，2009，136（2）：132－139.

［19］ Nam H Y，Nam K，Hahn H J，et al.Biodegradable PAMAM ester for enhanced transfection efficiency with low cytotoxicity［J］.Biomaterials，2009，30（4）：665－673.

［20］ Deng JunJie，Li Na，Mai KaiJin，et al.Star－shaped polymers consisting of aβ－cyclodextrin core and poly（amidoamine）den－dron arms：binding and release studies with methotrexate and siRNA［J］.J Mater Chem，2011，21：5273－5281.

［21］ Wu Xin，Ding BaoYue，Gao Jing，et al.Second－generation aptamer－conjugated PSMA－targeted delivery system for prostate cancer therapy［J］.Int J Nanomedicine，2011，6：1747－1756.

［22］ Yu HaiJun，Nie Yu，Dohmen C，et al.Epidermal growth factor－PEG functionalized PAMAM－pentaethylenehexamine dendron for targeted gene delivery produced by click chemistry［J］.Biomacromolecules，2011，12（6）：2039－2047.

［23］ Felgner J H，Kumar R，Sridhar C N，et al.Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations［J］.J Biol Chem，1994，269（4）：2550－2561.

［24］ Akinc A，Langer R.Measuring the pH environment of DNA delivered using nonviral vectors：implications for lysosomal trafficking［J］.Biotechnol Bioeng，2002，78（5）：503－508.

［25］ Liu XiaoXuan，Rocchi P，Qu FanQi，et al.PAMAM dendrimers mediate siRNA delivery to target Hsp27and produce potent antiproliferative effects on prostate cancer cells［J］.Chem Med Chem，2009，4（8）：1302－1310.

［26］ Ren Yu，Kang ChunSheng，Yuan Xubo，et al.Co－delivery of as－miR－21and 5－FU by poly（amidoamine）dendrimer attenuates human glioma cell growth in vitro［J］.J Biomater Sci，2010，21（3）：303－314.

［27］ Jiang YanYan，Tang GuoTao，Zhang LiHong，et al.PEGylated PAMAM dendrimers as a potential drug delivery carrier：in vitro and in vivo comparative evaluation of covalently conjugated drug and noncovalent drug inclusion complex［J］.J Drug Target，2010，18（5）：389－403.

［28］ Menjoge A R，Rinderknecht A L，Navath R S，et al.Transfer of PAMAM dendrimers across human placenta：prospects of its use as drug carrier during pregnancy［J］.J Control Release，2011，150（3）：326－338.