胃腺癌組織中HDGF、VEGF的表達(dá)及意義

馬桂芳，李惠芬，楊 李

（鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城 224006）

胃腺癌是中國(guó)較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，死亡率居各種癌癥之首。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、凋亡異常及新生血管形成等與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分，在這個(gè)過(guò)程中有多種因子參與或影響了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。肝癌衍生生長(zhǎng)因子（hepatoma derived growth factor，HDGF）是Nakamura等［1］從肝癌細(xì)胞系HuH－7培養(yǎng)液中分離出的一種酸性肝素結(jié)合蛋白。眾多國(guó)內(nèi)外的研究表明HDGF的過(guò)表達(dá)與一些惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后緊密相關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前知道作用最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，它能增加血管的通透性，引起細(xì)胞外基質(zhì)的改變，促進(jìn)血管形成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移等發(fā)揮著重要的作用，它是獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃腺癌組織中HDGF、VEGF蛋白表達(dá)情況，為腫瘤的聯(lián)合治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鹽城市第一人民醫(yī)院病理科2011年1月至2011年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)的胃腺癌石蠟標(biāo)本47例，另取同期胃黏膜不典型增生組織標(biāo)本15例及因胃良性病變行部分胃切除的正常胃黏膜標(biāo)本10例作對(duì)照。47例胃腺癌患者標(biāo)本的選擇分別從年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等方面考慮，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療。

1.2 主要試劑 HDGF兔抗人多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)（bs－6537R），一抗工作液濃度1∶100；抗體稀釋液為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；VEGF鼠抗人單克隆抗體即用型（MAB－0243）、二抗及DAB顯色液均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組化染色方法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶連結(jié)法（S－P）檢測(cè)胃腺癌及正常胃黏膜組織中HDGF和VEGF蛋白的表達(dá)，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將存檔的石蠟塊行4μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水。切片置已加熱沸騰的PH6.0檸檬酸緩沖液中，繼續(xù)微波加熱15min修復(fù)抗原，然后用3%過(guò)氧化氫去離子水37℃孵育15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。一抗37℃孵育60min，后4℃過(guò)夜，二抗37℃孵育45min，鏈霉素抗生物素過(guò)氧化物酶37℃孵育45min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知的HDGF和VEGF陽(yáng)性的胃腺癌切片染色作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 HDGF蛋白以細(xì)胞核（少數(shù)細(xì)胞質(zhì)）內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性；VEGF蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性。每份標(biāo)本置高倍鏡下選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀，計(jì)算陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果分為4級(jí)：未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為“－”；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為“＋”；25%～50%為“＋＋”；＞50%為“＋＋＋”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行分析，HDGF與VEGF蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，HDGF與VEGF在胃腺癌中表達(dá)相關(guān)性用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDGF、VEGF蛋白在胃腺癌和正常胃組織中的表達(dá)HDGF蛋白在胃腺癌組織中陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒（封3圖1）。HDGF在胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為65.9%（31／47），低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織33.3%（5／15），正常胃黏膜組織20%（2／10）。結(jié)果顯示，HDGF蛋白在胃腺癌組織的表達(dá)高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織（χ2＝4.970，P＜0.05）和正常胃黏膜組織（χ2＝5.383，P＜0.05）。VEGF蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒（封3圖2）。VEGF在胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.2%（32／47），低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織20%（3／15），正常胃黏膜組織10%（1／10）。結(jié)果顯示，VEGF蛋白在胃腺癌組織的表達(dá)明顯高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織（χ2＝11.879，P＜0.01）和正常胃黏膜組織（χ2＝10.125，P＜0.01）。

2.2 HDGF、VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃腺癌組織中HDGF蛋白和VEGF蛋白表達(dá)都與腫瘤浸潤(rùn)的深度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤組織分化程度無(wú)明顯的相關(guān)性（表1）。

表1 胃腺癌HDGF與VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

2.3 胃腺癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)的相關(guān)性 在31例HDGF陽(yáng)性的胃腺癌組織中，VEGF陽(yáng)性者25例，占80.6%；16例HDGF陰性胃腺癌組織中，VEGF陽(yáng)性者7例，占43.8%，γ＝0.375，P＜0.01，相關(guān)分析表明，胃腺癌組織中HDGF蛋白的表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討 論

HDGF結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于高遷移率族蛋白－1（HMG－1）的氨基酸序列。近年來(lái)，隨著對(duì)HDGF的功能研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)HDGF對(duì)細(xì)胞增殖、組織器官生長(zhǎng)發(fā)育、血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)［2］等生物學(xué)行為有著重要的影響，而且在肝癌［3］、非小細(xì)胞肺癌［4］、結(jié)腸癌［5］、胃癌［6］、胰腺癌［7］、食管癌［8］等多種腫瘤中呈過(guò)表達(dá)，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃腺癌組織、胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中HDGF蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織中的HDGF蛋白表達(dá)水平明顯高于胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中的HDGF表達(dá)，提示HDGF異常的高表達(dá)參與胃腺癌的發(fā)生和發(fā)展。Yamamoto等［6］應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)317例胃癌組織中HDGF表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HDGF 1級(jí)182例，2級(jí)135例，HDGF指數(shù)水平2級(jí)病例腫瘤體積均較大，多呈侵襲性生長(zhǎng)，血管轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移率均較HDGF指數(shù)水平1級(jí)的病例高，且HDGF指數(shù)水平2級(jí)的患者5年生存率較1級(jí)低。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌組織中HDGF的表達(dá)水平隨患者臨床分期增加而增加，而且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌組織中HDGF的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HDGF的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，提示HDGF蛋白高表達(dá)在胃腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起重要作用。

腫瘤要不斷生長(zhǎng)，就必須有新生血管形成，而且腫瘤血管也是腫瘤轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)。目前，已知的促血管生成的因子有VEGF、FGF、COX－2等，其中 VEGF的作用最強(qiáng)，它在腫瘤新生血管形成以及腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中起重要作用［9－11］。其通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生，蛋白酶的表達(dá)，抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞重組，最終形成毛細(xì)血管，并且能夠增加血管的通透性，形成不成熟的血管網(wǎng)絡(luò)［12］。VEGF廣泛分布于體內(nèi)各組織，如腦、垂體、腎臟、腎上腺和卵巢等［13］。近年來(lái)，VEGF與惡性腫瘤的關(guān)系受到重視，開(kāi)展了較多研究，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織VEGF表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)腫瘤血管形成，是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中極為關(guān)鍵的步驟［14］。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌組織、胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中VEGF蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，提示VEGF為腫瘤的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，胃腺癌組織中HDGF蛋白的表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。Okuda等［15］通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)重組的HDGF的成纖維細(xì)胞株NIH3T3（HDGFNIH3T3），將HDGF－NIH3T3注入裸鼠體內(nèi)后形成肉瘤，經(jīng)觀察顯示此肉瘤組織中有豐富的血管形成。進(jìn)一步用CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析顯示有新生血管生成及VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，提示在胃腺癌中HDGF可能通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的生成而參與腫瘤血管形成的調(diào)節(jié)，而HDGF誘導(dǎo)VEGF生成的機(jī)制，可能是由于HDGF能夠增強(qiáng)VEGF啟動(dòng)子活性或直接與VEGF基因的結(jié)合域結(jié)合，促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄合成［15］。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，提示HDGF和VEGF的過(guò)表達(dá)與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到協(xié)同的促進(jìn)作用。

但二者之間確切的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及在胃腺癌形成中的作用、地位仍需進(jìn)一步研究，為胃腺癌的診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后提供一個(gè)新的更有效的指標(biāo)，也為胃腺癌的靶向治療提供新的方案。

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