華東部分地區(qū)豬群中豬薩佩羅病毒分子流行病學(xué)調(diào)查

蘭道亮，吉文匯，王長松，孫 煥，陳莫林，崔 立，童光志，華修國＊

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海200240；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

豬薩佩羅病毒（Porcine sapelovirus，PSV）是微球形，無囊膜包裹的一類RNA病毒，屬小RNA病毒科，由于最初從腹瀉豬的腸道中分離得到，所以先前統(tǒng)屬于腸道病毒屬中的豬腸道病毒Ⅱ群，稱為豬腸道病毒8型（PEV8）［1］。近年來，由于對腸道病毒基因組及進(jìn)化關(guān)系的深入研究，該病毒已單獨劃分為薩佩羅病毒屬［2］。PSV可引起豬腦脊髓灰質(zhì)炎、肺炎、繁殖障礙、心包炎、心肌炎、皮膚損傷、腹瀉等多系統(tǒng)綜合征，同時也可出現(xiàn)無明顯特征的亞臨床癥狀，但無論其以何種形式暴發(fā)，都會給養(yǎng)豬業(yè)帶來威脅。該病最早于20世紀(jì)60年代在英國發(fā)現(xiàn)［3］，隨后在北美、日本、澳大利亞等世界范圍內(nèi)的其他國家相繼報道［4-8］，而且在飼養(yǎng)豬群中感染率很高［9-10］。

近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展及畜產(chǎn)品流通渠道的增多，我國豬群中腸道、呼吸道、生殖器官疾病以及腦脊髓炎等多系統(tǒng)綜合征頻繁發(fā)生，長期以來豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬捷申病毒（PTV）被認(rèn)為是引起該類疾病的主要病原體［11］，但PSV這個經(jīng)典腸道病毒卻一直沒有引起相應(yīng)的重視。目前為止，我國還未見對PSV的系統(tǒng)性研究報道。但鑒于PSV也可引起類似的臨床癥狀且可混合感染，使我們不得不考慮PSV這一感染因素。目前，豬病的發(fā)生越來越復(fù)雜，在控制重點傳統(tǒng)病的同時，對于一些我國還沒有開展研究或研究力度不夠的傳染病進(jìn)行深入的研究也十分必要。因此，在我國開展PSV的研究工作，了解PSV流行情況，建立快速的病原學(xué)診斷方法，具有重要的意義。本研究主要通過設(shè)計的PSV鑒定引物，應(yīng)用RT-PCR方法對華東地區(qū)豬群中PSV進(jìn)行調(diào)查，通過序列比對分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系，為了解該病毒在華東地區(qū)的分布情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 2009年10月至2010年12月，從上海、江蘇、安徽等地的15個大中型養(yǎng)豬場（200頭～1 000頭母豬）共采集1月齡～5月齡臨床健康豬糞便樣本960份，其中從上海市崇明、浦東、閔行、南匯、金山區(qū)的6個豬場采集350份，從江蘇省宿遷市、鹽城市、鎮(zhèn)江市、蘇州市的4個豬場采集310份，從安徽省宿州市、阜陽市、滁州市、黃山市的5個豬場采集300份（表1），采集的新鮮豬糞便樣品立即置-80℃冰箱凍存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit pMD-18T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；PCR Mix、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒為上海前塵生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DH5αE.coli為天根生化公司產(chǎn)品。PCR儀PX2為美國Thermo Hybaid公司產(chǎn)品；核酸電泳儀Powerpac universalTM為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

表1 采樣地區(qū)及樣品數(shù)量Table 1 The areas and numbers of specimen

1.2 方法

1.2.1 樣本的處理及總RNA的提取 取在-80℃保存的樣品，冰上溶化。用PBS液將樣品按照1∶10的比例稀釋，渦旋振動5min。在4℃條件下以12 000r／min離心10min，取上清。處理后的糞便上清供下游提取遺傳物質(zhì)。然后取100μL糞便上清，利用Trizol法提取總RNA，具體操作方法按照Invitrogen產(chǎn)品說明書提取步驟進(jìn)行。

1.2.2 RT-PCR檢測 參考Palmquist J M等［12］設(shè)計的PSV 5′保守區(qū)的通用檢測引物，擴(kuò)增目的片段為 163bp。上游 引 物 PSV1：5′-GTGGCGACAGGGTACAGAAGAG-3′；下游引物 PSV-2：5′-GGCCAGCCGCGACCCTGTCAG-3′。以提取的樣本RNA為模板，按照Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)參數(shù)為：42℃30min，85℃5s。然后取10μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：模板10μL，PCR mix 25μL；上游引物1μL；下游引物1μL；ddH2O為13μL。反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，56℃40s，72℃40s，35個循環(huán)；72℃5 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 PSV RdRp基因及VP1基因序列擴(kuò)增 參考GenBank中已有PSV基因序列，自行設(shè)計擴(kuò)增RdRp及VP1基因全長引物。RdRp基因擴(kuò)增引物：上游引物 RdRp-F：5′-GCAGCCCTGTTGAAGAGAGACT-3′；下游引物RdRp-R：5′-ATA TGTTCACGCCGCCTAAAA-3′；VP1基因擴(kuò)增引物：上游 引 物 VP1-F：5′-ATTGCCTAYACACCACCTGG-3′；下 游 引 物 VP1-R：5′-GCAGGTCTTCTCCCACAAAC-3′；參照1.2.2所述方法，對 PSV RdRp基因及VP1基因全序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.2.4 序列的克隆及測序 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物利用10g／L和50g／L凝膠電泳進(jìn)行檢測。特異性目的條帶經(jīng)割膠、純化回收后連接pMD-18T載體，隨后進(jìn)行T／A克隆，挑取陽性重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析 本試驗所得序列及其參考序列均整理成Fasta格式，通過ClustaXv1.8比對后保存生成的文件采用Mega 4.0系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。本試驗中使用的小RNA科不同種屬病毒名稱及參考株序列號如下：

AiV，aichivirus（FJ890523）；ASV，avian sapelovirus（NC-006553）；BEV，bovine enterovirus（AF123432）；EMCV，encephalomyocarditis virus（NC-001479）；PEMCV，porcine encephalomyocarditis virus（DQ835184）；ERAV，equine rhinitis A virus（NC-003982）；ERBV，equine rhinitis B virus（NC-003077）；FMDV，foot-and-mouth disease virus （GU384683）； HAV，hepatitis A virus（EU526088）； HEV， human enterovirus（AB678778，HM185056，JN542510，AB601882）；HPeV，human parechovirus（AB668033）；HRV，human rhinovirus（JN990704，JN614997）；LjV，ljungan virus（NC-003976）；PEV，porcineenterovirus（Y14459，AF363455）；PKV，porcine kobuvirus （GU298977）；PSV，porcine sapelovirus（NC-003987，AY392543，AY392556，AY392544，AY392538）；PTV，porcine teschovirus （NC-003985）；SHAV，simian hepatitis A virus（SHVAGM27）；SV，simian sapelovirus（EU789367）。

2 結(jié)果

2.1 PSV檢測結(jié)果

960份臨床糞便總樣本，經(jīng)RT-PCR檢測，共有165份樣本為PSV陽性樣本，總體陽性率為17.2%。各地區(qū)PSV陽性率如表2所示，其中安徽地區(qū)的PSV陽性感染率要明顯高于上海和江蘇地區(qū)（P＜0.05）。進(jìn)一步分析不同年齡段豬的PSV陽性率，我們發(fā)現(xiàn)10周齡～20周齡的豬PSV陽性率最高，達(dá)到25.6%，大于20周齡的豬PSV陽性率最低為11.6%（表3），這表明10周齡～20周齡的豬的PSV感染率要顯著高于其他周齡的豬（P＜0.05）。

表2 華東地區(qū)15個豬場PSV的流行情況Table 2 Prevalence of PSV in 15farms located in East China

表3 不同年齡段豬的糞便樣本中PSV檢測結(jié)果Table 3 The prevalence of PSV in swine feces of different ages

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 RdRp及VP1基因序列分析 從上海、江蘇、安徽三省市的陽性樣本中，各隨機(jī)選取8個樣本，擴(kuò)增其RdRp基因及VP1基因全序列，并測序。然后，對這選取的24株P(guān)SV中國華東株分別進(jìn)行RdRp基因及VP1基因的同源性比對。結(jié)果表明，這24株P(guān)SV中國華東株的RdRp基因間的同源性為87.0%～99.9%，同源性較高，而VP1基因間的同源性為72.4%～99.4%。

2.2.2 以RdRp基因為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用ClustaX v1.8，將24株P(guān)SV中國華東株的RdRp基因序列與小RNA病毒科其他代表毒株的RdRp基因序列進(jìn)行核苷酸比對，然后使用Mega 4.0系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），本研究分離的毒株與GenBank中已有的PSV V13株聚為一類，且與SV-2和ASV同屬于薩佩羅病毒屬，而與小RNA病毒科的其他成員相距較遠(yuǎn)。說明本研究分離的毒株為PSV，符合ICTV的分類條件。

2.2.3 以VP1基因為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將24株P(guān)SV中國華東株的VP1基因序列與微RNA病毒科其他代表毒株的VP1基因序列進(jìn)行核苷酸比對，然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），上海、江蘇和安徽三省市的毒株交錯分布在一起，不存在明顯的地區(qū)差異，但大體可分為3個亞群，其中7株與Gen-Bank中已有的PSV V13、16-S-X、26-T-XII株聚為一個亞群，3株與GenBank中已有的PSV Sek1562／98、Po 5116株聚為一個亞群，而剩下的又聚為一個亞群。

3 討論

PSV很早便于英國發(fā)現(xiàn)，隨后在北美、日本、澳大利亞等世界范圍內(nèi)的其它國家相繼有報道，而且在正常飼養(yǎng)豬群中感染率超過20%［9］。PSV可引起豬腸道、呼吸道、生殖器官疾病以及腦脊髓炎等多系統(tǒng)綜合征，同時也可出現(xiàn)無明顯特征的亞臨床癥狀，所以在疾病檢測和防控方面容易被忽略。目前，我國尚未對PSV開展深入研究，而且PSV在我國的流行情況還不十分清楚。

本研究通過RT-PCR方法對中國華東地區(qū)豬群中PSV的感染率進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，從上海、江蘇、安徽三省市的13個地區(qū)收集的960份臨床健康豬糞便樣本中，共檢測到PSV陽性樣本165份，總體陽性率17.2%，并且在所檢測的13個地區(qū)均檢測到該病毒，這表明PSV在華東地區(qū)普遍存在。在所檢測的3個省市中，安徽省豬群平均感染率最高為22.3%，上海市豬群平均感染率最低為13.1%，在所檢測的13個地區(qū)中，情況類似，安徽省的阜陽地區(qū)豬群感染率最高為25.3%，上海市的崇明地區(qū)豬群感染率最低為10.0%，而江蘇省地區(qū)豬群的感染率介于二者之間。造成不同地區(qū)的感染率差異的原因可能與地區(qū)間的養(yǎng)殖狀況以及飼養(yǎng)管理方式有關(guān)。進(jìn)一步分析不同年齡段豬的PSV陽性率，我們發(fā)現(xiàn)10周齡～20周齡的豬PSV陽性率最高，達(dá)到25.6%，表明在此年齡段的仔豬最易感，這與PEV的感染狀況類似［12-13］。我國仔豬的哺乳期在一般為4周～9周，由于哺乳期仔豬受到母源抗體保護(hù)，對PSV具有一定的抵抗力，而相關(guān)抗體在斷奶3周后降至最低［14-15］，所以易于受到PSV感染。這也提示加強(qiáng)斷奶仔豬，尤其是10周齡～20周齡仔豬的飼養(yǎng)管理，對于防控PSV有重要意義?？傮w來說，我國華東地區(qū)豬群中PSV的感染流行率，與國外報道的情況基本相同。但臨床健康豬群中20%以上的感染率不能不視其為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要潛在威脅。

隨后從上海、江蘇、安徽三省市的陽性樣本中，隨機(jī)選取24個樣本，擴(kuò)增其RdRp基因及VP1基因全序列，進(jìn)行相關(guān)系統(tǒng)進(jìn)化分析。以RdRp基因為基礎(chǔ)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其與小RNA病毒科其他種屬之間的關(guān)系，結(jié)果表明本研究分離的毒株與已有的PSV株歸為一類，且與SV-2和ASV同屬于薩佩羅病毒屬，而與小RNA病毒科的其它成員相距較遠(yuǎn)。由于RdRp基因在小RNA病毒科各種屬成員中具有較高的保守性，成為區(qū)分小RNA病毒科中不同種屬成員的有力依據(jù)。同時，從RdRp基因進(jìn)化樹中也可發(fā)現(xiàn)薩佩羅病毒屬與腸道病毒屬各歸為一類，存在一定的遺傳距離，這與國際病毒分類委員會將PSV從原先的PEV腸道病毒屬中單獨劃分出來的分類相符。進(jìn)一步以PSV的外層衣殼蛋白基因VP1為基礎(chǔ)構(gòu)建進(jìn)化樹，分析24株P(guān)SV中國華東株間的進(jìn)化關(guān)系。由于外層衣殼蛋白VP1在小RNA病毒科各種屬間具有多變性及良好的抗原性，所以被認(rèn)為是劃分小RNA病毒科各種屬間不同亞型的有力依據(jù)［9，16］。VP1基因進(jìn)化樹分析表明上海、江蘇和安徽三省市的毒株交錯分布在一起，不存在明顯的地區(qū)差異，但大體可分為3個亞群，而且已有的國外PSV均包括在這3亞群中。目前，PSV只有1個血清型，但PSV是否存在不同的基因亞型尚不清楚。Tseng C H等［2］證實PSV存在3種類型的抗原變異株，與本研究的進(jìn)化分析結(jié)果相似，這提示PSV可能至少存在3種不同的抗原基因亞型。但關(guān)于PSV的亞型分型國際上尚無定論，還需進(jìn)一步深入研究加以證實。

圖1 基于RdRp基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree constructed based on the RdRp gene sequence

圖2 基于VP1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed based on the VP1gene sequence

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