抗球蟲新藥納川珠利在大鼠肝S9中的代謝穩(wěn)定性研究

李素梅，張可煜，王霄旸，李 濤，薛飛群

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室，上海200241）

球蟲病是雞、火雞、兔等畜禽的常見寄生蟲，每年給養(yǎng)雞業(yè)、養(yǎng)兔業(yè)造成巨大損失，三嗪類抗球蟲藥是當前預(yù)防和治療球蟲病較有效的藥物［1］。然而，地克珠利（diclazuril）和妥曲珠利（toltrazuril）等藥物由于長期使用，已經(jīng)導(dǎo)致非常嚴重的耐藥性問題［2-3］。納川珠利是新型的三嗪類抗球蟲藥物，已有報道顯示該藥不僅具有良好的抗球蟲效果，抗球蟲指數(shù)（ACI）達185～200［4］，與地克珠利、妥曲珠利等其他三嗪類化合物無交叉耐藥性，且安全性好、毒副作用低，具有廣闊的應(yīng)用前景。作為國家一類新獸藥開發(fā)的納川珠利的代謝特征目前尚無相關(guān)研究報道。

肝臟是機體進行生物轉(zhuǎn)化的主要場所，以肝臟為基礎(chǔ)的體外代謝模型在藥物代謝中應(yīng)用廣泛，其與體內(nèi)代謝相比具有以下優(yōu)點：①體外代謝可以排除體內(nèi)諸多的干擾因素，直接觀察代謝酶對底物的選擇性代謝，為體內(nèi)代謝的研究提供重要線索。②體外代謝具有快速簡便的特點，適合大量化合物的藥動學(xué)篩選。③試驗過程中，無需消耗大量的樣品和試驗動物，降低了研究費用［5］。

研究藥物體外代謝的方法主要有肝微粒體孵育法、肝細胞系孵育法、肝S9孵育法、原代肝細胞孵育法等。肝微粒體法因操作簡易得到廣泛應(yīng)用，但其缺乏除CYP450及UGTs以外的其他代謝酶，可能導(dǎo)致某些代謝物的丟失；肝細胞系容易培養(yǎng)，但此類細胞不表達或僅少量表達相關(guān)代謝酶，這大大的限制了該系統(tǒng)的應(yīng)用；原代肝細胞系統(tǒng)克服了代謝酶表達量少的問題，然而制備過程復(fù)雜，在初步篩選中較少運用。肝S9系統(tǒng)制備簡便，且該系統(tǒng)所含的酶比肝微粒體更豐富，適合對藥物體外代謝進行初步篩選［6］。本研究利用高效液相方法研究了納川珠利與大鼠肝S9孵育的代謝穩(wěn)定性及可能存在的代謝物［7-13］，為進一步研究納川珠利在體內(nèi)的消除規(guī)律、確證代謝產(chǎn)物和指導(dǎo)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters 2690高效液相色譜儀，Waters 2487檢測器，Thermo高速離心機，渦旋振蕩混合器，上海凌初環(huán)保儀器有限公司生產(chǎn)；超純水系統(tǒng)，上海瑞楓生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑 納川珠利對照品（含量99.81%，批號20101210）為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)研究室制，大鼠肝S9為Biology Toxicity產(chǎn)品，6-磷酸葡萄糖（G-6-P），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）輔酶Ⅱ（NADP）為Roche產(chǎn)品，色譜純乙腈為Fisher產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.1.3 對照品儲備液和工作液的配制 精密稱取納川珠利對照品20mg，置于10mL容量瓶中以二甲基亞砜 （DMSO）溶解稀釋至刻度，制成2mg／mL的對照品儲備液。精確量取1mL儲備液于10mL容量瓶中，以pH 7.5濃度為0.1mol／L的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得0.2mg／mL的工作液。

1.2 方法

1.2.1 孵育條件 試驗組反應(yīng)體系中肝S9蛋白濃度為2mg／mL，其中NADPH還原系統(tǒng)各組分含量如下：1mmol／L NADP、10mmol／L 6-磷酸葡萄糖、2U／mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、7mmol／L MgCl2。該反應(yīng)體系放入37℃水溫箱，預(yù)孵育5min后，加入納川珠利工作液50μL，反應(yīng)體系終體積為0.5mL。對照組于反應(yīng)體系預(yù)孵育5min后加入50μL 0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），其他均與試驗組相同。取不同孵育時間的樣品加入2倍體積的乙腈，混合渦旋終止反應(yīng)。4℃、5 000r／min離心15min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進樣分析。

1.2.2 色譜條件 Dikma（2.0mm×150mm，5μm）C18色譜柱；柱溫30℃；流動相為乙腈︰1 mL／L甲酸水=50︰50；流速為1mL／min；檢測波長為300nm，進樣量15μL。

1.2.3 方法專屬性 按1.2.1處理方法，1.2.2色譜條件考察對照組與試驗組在試驗條件下的色譜行為，考察該方法的專屬性。

1.2.4 納川珠利溶液的穩(wěn)定性 取50μL納川珠利工作液加入450μL磷酸鹽緩沖液中，置于37℃溫箱48h后 ，加入1 000μL乙腈，混勻后經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進樣分析，考察納川珠利在37℃下的穩(wěn)定性。

1.2.5 工作曲線的制備 精密量取納川珠利工作液，置于37℃ 預(yù)孵育5min后的大鼠肝S9反應(yīng)體系中，配制成分別含0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg／mL納川珠利的系列樣品，終體積為0.5mL，立即加入1mL乙腈混合，4℃、5 000r／min離心15 min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后上樣分析。以納川珠利峰面積（Y）對其濃度（X）進行線性回歸。

1.2.6 最低檢測限 按照1.2.5分別配制并處理0.1、0.2、0.5mg／mL系列樣品，1.2.2色譜條件考察最低檢測限，即當S／N=3時的樣品濃度。

1.2.7 回收率及精密度測定 選取0.5、2.0、20.0 μg／mL為高、中、低3個濃度為質(zhì)控樣品，按照1.2.5處理后進樣，求方法回收率。分別按照測定方法每個濃度平行測定5個樣品；并連續(xù)重復(fù)3d，計算日間日內(nèi)精密度。

1.2.8 納川珠利在大鼠肝S9的代謝穩(wěn)定性 取0、0.5、1.0、2.5h時的孵育液，每個時間點設(shè)3個樣品，每個樣品測量3次，代入工作曲線回歸方程，計算孵育液中納川珠利的濃度。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

對照組與試驗組色譜圖顯示納川珠利的出峰時間為10.9min（圖1B中2），且分離度良好，對納川珠利的專屬性好。同時，與對照組相比較，試驗組色譜圖監(jiān)測到代謝產(chǎn)物1，其出峰時間為2.4min（圖1B中1）

圖1 對照組與試驗組色譜圖Fig.1 Chromatogram of the control group and the experimental group

2.2 納川珠利溶液的穩(wěn)定性

納川珠利溶液置于37℃溫箱48h后，按1.2.2測定納川珠利的峰面積變化小于0.7%，結(jié)果顯示藥物在孵育環(huán)境中穩(wěn)定。

2.3 工作曲線與最低檢測限

納川珠利峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，得到納川珠利在S9孵育體系中的線性方程為Y=48 529X＋403.95R2=1.000，線性范圍為0.5 μg／mL～20.0μg／mL，最低檢測限為0.1μg／mL。

2.4 回收率及精密度

高、中、低3個濃度，每個濃度平行測定5個樣品，并3d內(nèi)重復(fù)3次的回收率及精密度如表1。結(jié)果顯示其回收率在96%～101%之間，日內(nèi)精密度低于2.3%，日間精密度低于5.6%，回收率及精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

表1 納川珠利回收率及精密度試驗結(jié)果（n=5）Table 1 The results of recovery and precision of natromezuril（n=5）

2.5 納川珠利在大鼠肝S9的代謝穩(wěn)定性

納川珠利與大鼠肝S9孵育2.5h后約代謝了42%。0～1h內(nèi)藥物濃度從20.03μg／mL（C0）線性下降到15.07μg／mL（C），代謝符合一級反應(yīng)的特征（圖2）。以lnC／C0-t作線性回歸，消除公式為：lnC／C0=-1.842t＋7.264，R2=0.999 5，由公式K.t=lnC0／C；t1／2=ln2／K進一步計算可得反應(yīng)速率常數(shù)K=0.004 719min-1，t1／2=146.88min。與納川珠利的代謝消除對應(yīng)的是0h～1h內(nèi)代謝產(chǎn)物1亦呈線性增加，進一步利用色譜峰面積進行比較，發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物1的峰面積為納川珠利孵育前后峰面積差的36%（圖3）。

圖2 納川珠利在大鼠肝S9中代謝消除趨勢Fig.2 Metabolic elimination tendency of natromezuril in hepatic S9

圖3 納川珠利代謝物的時間-峰面積圖Fig.3 Time-peak area graph of the metabolite of natromezuril

3 討論

本研究成功建立了大鼠肝S9孵育液中納川珠利含量的檢測方法，方法回收率高，高、中、低3個質(zhì)控濃度下的回收率均大于90%，日內(nèi)和日間精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

考慮到孵育時間過長，一方面會影響酶的活力，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不具分析性；另一方面會導(dǎo)致樣品變質(zhì)，使得制備的工作曲線方程不適用于含量分析。因此本研究選取2.5h為孵育時間，發(fā)現(xiàn)0～1h范圍內(nèi)納川珠利在大鼠肝S9孵育液中呈線性消除，符合一級反應(yīng)的特征，反應(yīng)速率常數(shù)K=0.004 719 min-1，t1／2=146.88min，表明該代謝系統(tǒng)對納川珠利具有較弱的代謝能力，納川珠利具有較高的代謝穩(wěn)定性。本研究同時還監(jiān)測到納川珠利代謝產(chǎn)物1，其在0～1h內(nèi)隨納川珠利濃度的下降而呈線性增加，約占納川珠利藥物代謝總量的36%。

本研究初步確定了納川珠利在大鼠肝S9系統(tǒng)中具有較高的代謝穩(wěn)定性，并監(jiān)測到可能存在的代謝產(chǎn)物，為進一步鑒定納川珠利的代謝產(chǎn)物及結(jié)構(gòu)，研究納川珠利在體內(nèi)外的代謝和消除規(guī)律提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ 索 勛，李國清.雞球蟲病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998：166-167.

［2］ 韓春來，王麗明，鄭明學(xué)，等.雞球蟲的耐藥性研究進展［J］.畜禽業(yè)，2001（4）：32-33.

［3］ 金光明，程從升，顧有方，等.2株柔嫩艾美耳球蟲對5種抗球蟲藥的抗藥性［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23（1）：40-41.

［4］ 費陳忠，韓春周，林 洋，等.抗雞球蟲病的三嗪類新化合物納川珠利的藥效試驗［J］中國獸藥雜志，2010，44（7）：11-12，31.

［5］ 陳萬平，孫 翔，程鵬遠.體外藥物肝代謝研究進展［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（9）：861-863.

［6］ Esther F.An update onin vitrotest methods in human hepatic drug biotransformation research：pros and cons［J］.Toxicol Apll Pharmacol，2003（189）：233-246.

［7］ 姚彤煒，胡云珍.地非三唑在鼠肝微粒體中的體外代謝［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2002，16（2）：128-132.

［8］ WU W N，Linda A.In vitro metabolism of the new anxiolytic agent，RWJ-52763in human hepatic S9fraction-API-MS／MS identification of metabolites［J］.J Pharm Biomed Anal，2003，31：95-102.

［9］ 欒連軍，邵 青，曾 蘇.高效液相色譜分離法測定大鼠肝微粒體中普洛萘爾葡醛酸化代謝產(chǎn)物［J］.藥學(xué)學(xué)報，2001，36（12）：921-924.

［10］ Vergote V，Dorpe S V，Premans K，et al.In vitro metabolic stability of obestatin：Kinetic and identification of cleavage products［J］.Peptides，2008，29：1740-1748.

［11］ 廖作莊，梁 鋼，歐冰凝.表沒食子兒茶素沒食子酸酯體外代謝的方法研究［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2011，33（1）：5-7.

［12］ 崔升淼，趙春順，高 坤，等.大鼠肝微粒體中葛根素的液相色譜-質(zhì)譜測定法及藥物代謝動力學(xué)［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2007，24（1：32-35.

［13］ Huang J G，Si L Q，F(xiàn)an Z Z，et al.In vitro metabolic stability and metabolite profiling of TJ0711hydrochloride，a new developed vasodilatoryβ-blocker，using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method［J］.J Chromatography B，2011，879：3386-3392.