奶水牛血清和卵泡液中瘦素水平的相關(guān)性研究

杜玉蘭，畢芳芳，何寶祥

（1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧530005；2.廣西大學行健文理學院，廣西南寧530005）

自從1994年Zhang Y等［1］在小鼠發(fā)現(xiàn)瘦素 （leptin）蛋白以來，引起了全世界研究者的廣泛興趣。leptin蛋白主要是由脂肪細胞合成和分泌的一種多肽類激素，leptin基因缺失小鼠會發(fā)生過度采食、過度肥胖和不育癥。Campfield L A等［2］給leptin基因缺乏小鼠注射重組leptin，不僅可使該leptin基因缺失小鼠的食欲和體重減少 ，而且可使其生殖能力恢復(fù)。研究表明leptin受體分布于動物的多種組織，如下丘腦、垂體以及外周組織如心、肝、肺、生殖組織（卵巢、子宮、乳腺）、胃腸道等［3］，證明該激素與能量代謝［4］、繁殖［5］、發(fā)育編程等［6］、免疫［7］、炎癥和疾?。?］的調(diào)節(jié)有關(guān)。Leon J S［9］指出，在leptin與繁殖的關(guān)系方面，人們普遍認為leptin通過下丘腦-垂體-卵巢軸發(fā)揮對繁殖的調(diào)節(jié)作用，但也有可能存在著它對卵巢的直接作用，有人證明leptin除了脂肪細胞合成外，也可以在卵母細胞、顆粒細胞及胎盤組織中合成，leptin能與卵泡顆粒細胞特異性結(jié)合。已有研究證明leptin與動物和人類的性甾體激素調(diào)節(jié)有關(guān)。在leptin的臨床應(yīng)用方面，已經(jīng)有藥用型leptin，即重組甲二磺酰人瘦素（recombinant methionyl human leptin）用于病人的治療［10］，它是leptin基因的滅活突變體，也是目前唯一能用于病人的藥用型leptin，試驗證明它能改善leptin缺乏病人的代謝異常，能使因leptin變異所致肥胖者的體重顯著減輕，患leptin缺乏的、脂肪營養(yǎng)不良綜合征的病人可用該藥物進行治療。

在反芻動物和其他動物，血漿leptin水平與機體脂肪儲量相關(guān)。有人認為通過它和IGF-1將營養(yǎng)狀況信號傳到大腦中樞，調(diào)節(jié)動物生殖功能。在人類已有研究檢測血液和卵泡液中l(wèi)eptin水平的報道，但在水牛的資料非常少見。奶水牛是我國南方地區(qū)的主要大家畜品種之一，近年來對奶水牛的發(fā)展受到政府和農(nóng)民的高度重視，奶水牛在農(nóng)民增收和國民經(jīng)濟中占有重要地位，但水牛的營養(yǎng)與繁殖問題一直困擾著奶水牛業(yè)的發(fā)展，leptin關(guān)聯(lián)著營養(yǎng)與繁殖。本研究試圖通過檢測奶水牛血清和卵泡液中l(wèi)eptin水平，探討兩者間是否存在相關(guān)性，為進一步研究奶水牛繁殖與營養(yǎng)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 leptin放射免疫試劑盒為北京北方生物研究所生產(chǎn)；測定儀器使用DFM-96型放射免疫計數(shù)儀，為合肥眾成機電技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗用動物及樣品采集 被檢奶水牛選自南寧市某屠宰場待屠宰的奶水牛44頭，均為雌性，臨床檢查均健康，營養(yǎng)狀況中等，年齡2歲～6歲，體重250kg～400kg。樣品采集時保證每頭牛都有血液和卵巢樣品。血樣在宰殺前采集，宰殺后收集卵巢，將卵巢帶至實驗室盡快分離卵泡液。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 在清晨奶水牛宰殺前，頸靜脈采血，收集于事先準備好的干凈試管內(nèi)，帶回廣西大學臨床獸醫(yī)學實驗室，室溫放置分離血清，血清收集后及時置于-20℃冰箱，待被檢樣品全部準備就緒后，進行l(wèi)eptin測定。

1.2.2 卵泡液收集 在奶水牛宰殺后，立即無菌摘除卵巢，帶回實驗室，檢查卵巢上卵泡的大小，對直徑大于8mm以上的卵泡（確認為第3期卵泡），用1 mL注射器抽取卵泡液，要求抽出的卵泡液清亮、未發(fā)生血液污染。卵泡液盛于準備好的試管里，置于-20℃冰箱存放，待被檢卵泡液樣品采集完成后，與血清樣品一起，同時分析leptin含量。

1.2.3 測定方法 采用放射免疫法測定，leptin試劑盒購于北京北方生物研究所，分析工作在廣西醫(yī)科大學內(nèi)分泌實驗室進行，按照試劑盒說明書進行測定。敏感度為0.2ng／mL，批內(nèi)和批間誤差分別為4.5%和6.7%。

1.2.4 統(tǒng)計分析 使用Excel軟件，血清和卵泡液中的leptin含量檢測結(jié)果用平均數(shù)±標準差。相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

表1 奶水牛血清和卵泡液中l(wèi)eptin水平Table 1 The leptin levels of serum and follicular fluid in dairy buffalo

本試驗共采集奶水牛血樣44份，卵泡液樣本34份（10頭奶水牛無大卵泡），leptin水平檢測結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計檢驗，血清leptin水平顯著高于卵泡液的水平。對34頭奶水牛的血清和卵泡液leptin水平的相關(guān)性分析結(jié)果見圖1。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)達0.438，統(tǒng)計檢驗發(fā)現(xiàn)兩者間的相關(guān)性達到極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 奶水牛血清和卵泡液中l(wèi)eptin水平的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of leptin levels of serum and follicular fluid in dairy buffalo

3 討論

3.1 血清leptin水平

本研究采用放免法檢測了奶水牛血清中l(wèi)eptin水平，被檢的44頭奶水牛的平均水平為2.14ng／mL±0.75ng／mL。其中34頭卵泡期水牛的為2.04 ng／mL±0.69ng／mL，10頭黃體期水牛的為2.36 ng／mL±0.96ng／mL。我們研究小組曾對16頭荷斯坦奶牛，均在分娩前后做了11次檢測，發(fā)現(xiàn)血清leptin水平在2.99ng／mL±1.31ng／mL。關(guān)于水牛血清leptin水平的檢測國內(nèi)外報道很少，Campanile G等［11］在研究高、低兩種不同能量的日糧對頭胎摩拉水牛代謝和卵巢功能的影響時，報道了用放免法測定高能量組水牛血中l(wèi)eptin水平顯著高于低能量組的水平（2.6ng／mL±0.2vs 1.8ng／mL±0.0ng／mL，P＜0.05），我們研究的被檢牛血中l(wèi)eptin水平介于上述2組水平之間。李恭賀等［12］用ELISA方法檢測發(fā)情前后水牛的血清leptin水平的動態(tài)變化，其測定范圍在6ng／mL～18ng／mL之間，這是由于不同的檢測方法所致。目前人們普遍認為，血清leptin可以抑制食欲、增加脂肪降解，抑制脂肪合成、增加能量開支。禁食可使其血漿水平下降，采食后可使其水平迅速升高。血清leptin水平主要反映動物體內(nèi)脂肪儲存情況。在能量代謝正平衡時期，肥胖動物的血漿leptin水平高，而消瘦者的低。本研究檢測奶水牛的血清leptin水平，最低值0.94ng／mL，最高者為3.71 ng／mL，與被檢水牛的臨床營養(yǎng)狀況一致。眾所周知，奶水牛的營養(yǎng)體況與繁殖有一定關(guān)系，我們的研究發(fā)現(xiàn)，放牧飼養(yǎng)的不少水牛營養(yǎng)很差，很難受孕，因此推測，可能奶水牛消瘦，血液和卵泡液中的leptin水平較低，動物機體在營養(yǎng)與繁殖之間的調(diào)節(jié)機制中就確定不能受孕。營養(yǎng)不良不僅影響母畜繁殖性能，還會影響后代的繁殖能力，Tatiane D等［13］研究成年大鼠泌乳期間營養(yǎng)不良對其后代的卵泡產(chǎn)生、促性腺激素和leptin受體的表達影響，發(fā)現(xiàn)母鼠泌乳期間營養(yǎng)不良可使子鼠的卵泡（原始、初級、有腔）數(shù)量顯著減少，使leptin和leptin受體和不同亞型的leptin受體（Ob-Rb）、芳香化酶和促性腺激素受體的mRNA表達量都顯著減少。這些變化可能是母鼠圍產(chǎn)期leptin水平改變的結(jié)果，說明leptin水平在出現(xiàn)長期營養(yǎng)代謝變化中對繁殖起著關(guān)鍵性的決定作用。今后應(yīng)加強對母水牛包括泌乳期在內(nèi)的各個生理階段的營養(yǎng)研究，開展受孕和不孕動物間的leptin水平研究，以期進一步發(fā)現(xiàn)影響水牛繁殖率的營養(yǎng)機制。最新對奶牛的研究已經(jīng)表明，乏情組奶牛血清中l(wèi)eptin濃度顯著低于發(fā)情組，是導致奶牛乏情的直接原因［14］。

3.2 卵泡液leptin水平

國內(nèi)外對奶水牛卵泡液leptin水平的報道尚未見到，我們對34頭卵泡期水牛卵泡液的檢測結(jié)果表明，leptin平均值為0.69ng／mL，顯著低于血清水平。有報道［15］顯示人類在采用超排技術(shù)與體外撿卵（OPU）時，其卵泡液與血清中l(wèi)eptin水平幾乎一致（血清23.8ng／mL±20.9ng／mL，卵泡液23.7 ng／mL±20.5ng／mL），這是否由于在人使用了超排藥物所致有待研究。水牛卵泡液leptin水平低，只有血清水平的32.2%，雖然供抽樣的卵泡都是大卵泡（＞8mm），但最低值只有0.05ng／mL。Gastal M O等［16］報道，短期飼喂限制降低了母馬血液和卵泡液中的leptin水平，在限飼48h達到顯著水平，限飼48h血液leptin水平在4ng／mL～6ng／mL之間，卵泡液leptin水平為1.8ng／mL～3.0ng／mL之間，而未限飼的對照母馬，血液和卵泡液中的leptin水平分別為9ng／mL～10ng／mL和4.5ng／mL～6.9ng／mL。

3.3 血清和卵泡液leptin水平相關(guān)性分析

本研究首次報道了水牛的leptin水平在血清和卵泡液之間存在著顯著的相關(guān)性（r=0.438，n=34，P＜0.01），目前我們尚未看到水牛的相關(guān)報道。在對人類的研究中，有報道稱，血中l(wèi)eptin水平在月經(jīng)周期內(nèi)波動，月經(jīng)前比月經(jīng)后高，妊娠時比絕經(jīng)后的高。Birgül G等［15］發(fā)現(xiàn)，OPU當天的血清leptin水平與卵泡液的水平相似，并存在著極顯著的相關(guān)性（r=0.996，P＜0.001）。OPU當天的血清leptin水平平均比基礎(chǔ)水平升高66.4%，這種leptin水平的升高與卵泡期婦女的體重指數(shù)呈現(xiàn)強正相關(guān)（r=0.782，P＜0.01）。我們收集的是自然狀態(tài)下的水牛卵泡液，未做超排處理，是否超排處理會引起奶水牛血清和卵泡液之間leptin水平差異變化，有待研究證實。Gastal M O等［16］雖然檢測了母馬血液和卵泡液中的leptin水平，但未分析血液和卵泡液leptin水平的相關(guān)性，報道了卵泡液leptin水平與被檢母馬的體況呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，由此可提示leptin在聯(lián)系母馬的營養(yǎng)與繁殖性能之間發(fā)揮作用。

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