豬附紅細(xì)胞體感染途徑研究

司 唯，姚 琳，賈立軍，鞠玉琳

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002）

附紅細(xì)胞體?。ê?jiǎn)稱附紅體病）是由附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon）寄生于紅細(xì)胞表面或游離于紅細(xì)胞內(nèi)、血漿、組織液及腦脊液中引起的以發(fā)熱、溶血性貧血和黃疸為主要特征的人獸共患?。?-2］。豬附紅細(xì)胞體病嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，逐漸被人們所重視。由于各個(gè)年齡段、各種品種的豬均能感染豬附紅細(xì)胞體病，且仔豬發(fā)病率高，死亡率也高，如不能及時(shí)有效地控制該病的傳播，無(wú)疑會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)十分慘重的代價(jià)［3］。所以，明確豬附紅細(xì)胞體病的傳播途徑就成為了防治該病工作中的重中之重。針對(duì)這一現(xiàn)狀，我們?cè)噲D采用接觸感染（皮膚涂抹）、口服感染、傷口感染、皮下注射感染和呼吸道感染等5種途徑進(jìn)行試驗(yàn)，以確定豬附紅細(xì)胞體病的傳播途徑，為豬附紅細(xì)胞體的防治提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病原體 昆明小鼠70只，20g～22g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。紅細(xì)胞的豬附紅細(xì)胞體感染率達(dá)95%以上的血液樣本，按照姚琳［4］方法制備紅細(xì)胞泥。

1.1.2 試劑與儀器 地塞米松（5mg／mL）為鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品；姬姆薩染色原液。低速離心機(jī)（DL-5-B），立式滅菌器（ES-315），電子天平（FA／JA1104），顯微鏡（OLYMPUS），通風(fēng)櫥。

1.2 方法

1.2.1 病原體的檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)［5-7］的方法對(duì)病原體分別進(jìn)行血液壓滴標(biāo)本檢測(cè)、姬姆薩染色檢測(cè)和PCR檢測(cè)。

1.2.2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn) 將35只小鼠隨機(jī)分為7個(gè)組，每組5只，進(jìn)行感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn)。7個(gè)小組分別為皮下組、皮膚組、口服組、傷口組、呼吸道組、呼吸道空白組以及空白組。小鼠腹腔注射地塞米松（0.2mL／只），2d1次，共3次。皮下組、皮膚組和口服組：分別采用皮下、皮膚、灌胃途徑接種0.5mL／只的紅細(xì)胞泥。傷口組：采用體側(cè)薄皮部劃痕接種方法接種0.5mL／只的紅細(xì)胞泥，劃痕長(zhǎng)度為1cm～2cm。空白組：皮下注射0.5 mL／只生理鹽水。呼吸道組：5只小鼠和紅細(xì)胞泥一并放置于密閉的通風(fēng)櫥內(nèi)一側(cè)，其中將紅細(xì)胞泥放置于冰盒上的平皿中7d，每6h更換一次冰袋。呼吸道空白組：條件同上，但不放置紅細(xì)胞泥。在上述條件下用相同的方法另選35只小鼠做相同的試驗(yàn)，但感染小鼠的紅細(xì)胞泥劑量為0.2mL／只。連續(xù)30d由小鼠尾部采血制成鮮血壓滴標(biāo)本，在400倍鏡下觀察并記錄、統(tǒng)計(jì)豬附紅細(xì)胞體在小鼠體內(nèi)的消長(zhǎng)情況曲線。

1.2.3 紅細(xì)胞感染情況觀察及計(jì)數(shù)方法 顯微鏡下選擇5個(gè)視野分別觀察豬附紅細(xì)胞體的感染情況，觀察紅細(xì)胞形態(tài)及紅細(xì)胞表面豬附紅細(xì)胞體的形態(tài)、大小、折光性并以百分率來(lái)表示感染率。

2 結(jié)果

2.1 病原體檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 血液壓滴標(biāo)本檢查 經(jīng)對(duì)感染豬附紅細(xì)胞體的豬血進(jìn)行血液壓滴標(biāo)本檢查，感染豬附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞邊緣不整，呈星芒狀、鋸齒狀、菠蘿樣形狀，紅細(xì)胞內(nèi)和血漿中可見(jiàn)豬附紅細(xì)胞體，大多呈球形、逗號(hào)形、條形細(xì)小顆粒狀，豬附紅細(xì)胞體在鏡下有折光性，并且紅細(xì)胞表面有黑色疤痕，紅細(xì)胞感染率達(dá)到95%以上。

2.1.2 姬姆薩染色標(biāo)本檢查 經(jīng)對(duì)感染豬附紅細(xì)胞體的豬血進(jìn)行姬姆薩染色標(biāo)本檢查，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察到紅細(xì)胞一般呈紫紅色，豬附紅細(xì)胞體則是在紅細(xì)胞體上可見(jiàn)藍(lán)紫色的具有折光性的疤痕。

2.1.3 PCR擴(kuò)增 以膜蛋白OxaA為引物，對(duì)血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分臨床樣本PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，血液樣本2、5、6、9分別在386bp處擴(kuò)增出較亮的電泳條帶，其他樣本均未擴(kuò)增出任何條帶，說(shuō)明樣本2、5、6、9可以作為病原體血液樣本。

選取經(jīng)3種方法共同檢測(cè)出的病原體為本試驗(yàn)的陽(yáng)性血液。

圖1 血液樣本的PCR鑒定Fig.1 PCR analysis of the blood samples

2.2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠感染紅細(xì)胞泥劑量0.5mL／只的結(jié)果

小鼠在注射地塞米松后，除空白組，各試驗(yàn)組小鼠均在感染豬附紅細(xì)胞體后，在第3天出現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，弓背聳毛的現(xiàn)象，第21天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常。空白組小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細(xì)胞體的觀察結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，5個(gè)感染試驗(yàn)組分別在不同程度上感染了豬附紅細(xì)胞體，其中傷口組和口服組在第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體，第6天時(shí)皮膚組、皮下組和呼吸道組都呈上升趨勢(shì)。在感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)傷口組和皮下組在第9天達(dá)到感染高峰并且傷口組的感染率最高，達(dá)到了96%。皮下組的感染高峰為20%；口服組、呼吸道組和皮膚組在第12天均出現(xiàn)感染高峰，感染率分別達(dá)到了89%、80%和19%。傷口組在第12天到第15天感染率急劇下降，直至第27天感染率為0；口服組和呼吸道組從第12天開(kāi)始均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，分別從第27天和第21天感染率降為0。

圖2 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體（0.5mL／只）情況Fig.2 The infection situation of E.suis（0.5mL）in mice

2.2.2 小鼠感染紅細(xì)胞泥劑量0.2mL／只的結(jié)果

小鼠在免疫抑制后，除空白組之外，各試驗(yàn)組小鼠均在感染豬附紅細(xì)胞體后第5天出現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，弓背聳毛的現(xiàn)象，第20天以后小鼠的精神狀態(tài)、食欲趨于正常。空白組小鼠精神狀態(tài)和食欲等均正常。30d內(nèi)的小鼠感染豬附紅細(xì)胞體的觀察見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠感染豬附紅細(xì)胞體（0.2mL／只）情況Fig.3 The infection situation of E.suis（0.2mL）in mice

由圖3可知，5個(gè)感染試驗(yàn)組分別在不同程度上感染了豬附紅細(xì)胞體，其中傷口組和口服組在第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體，第6天時(shí)皮膚組和呼吸道組出現(xiàn)感染情況，皮下組在第9天的時(shí)候出現(xiàn)感染情況。在感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)傷口組第12天達(dá)到感染高峰并且該組的感染率最高，達(dá)到了75%；口服組和呼吸道組在第18天和第15天出現(xiàn)感染高峰，感染率分別達(dá)到了35%和39%；皮下組在第18天達(dá)到高峰，感染率為41%。傷口組、皮膚組和呼吸道組在第15天開(kāi)始感染率急劇下降，分別在第24天、第18天和第21天降為0；口服組從第18天開(kāi)始均呈現(xiàn)均勻下降的趨勢(shì)，第27天感染率降為0。

3 討論

綜合本試驗(yàn)結(jié)果，傷口組的小鼠從第3天開(kāi)始感染豬附紅細(xì)胞體，第9天出現(xiàn)感染高峰，感染率達(dá)到96%，此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于傷口處于表皮層，豬附紅細(xì)胞體通過(guò)皮下組織與真皮交界處的深部血管網(wǎng)直接進(jìn)入動(dòng)脈?？诜M小鼠通過(guò)灌胃途徑在第12天感染率達(dá)89%，此結(jié)果的產(chǎn)生可能是豬附紅細(xì)胞體進(jìn)入消化系統(tǒng)后通過(guò)消化道黏膜、黏膜下膜、肌膜和漿膜進(jìn)入毛細(xì)血管，最終進(jìn)入全身血液循環(huán)，該組感染模型的維持時(shí)間最長(zhǎng)的原因也許是該組小鼠感染的豬附紅細(xì)胞體在體內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)所導(dǎo)致的。呼吸道組小鼠感染率在第12天達(dá)到高峰，感染率為80%，這一結(jié)果也許是因?yàn)樨i附紅細(xì)胞體通過(guò)小鼠呼吸系統(tǒng)進(jìn)入肺部的毛細(xì)血管進(jìn)而進(jìn)入肺動(dòng)脈，最后進(jìn)入全身血液循環(huán)。皮膚組小鼠感染率較低，僅為19%，并且維持時(shí)間較短，出現(xiàn)這一結(jié)果可能是由于豬附紅細(xì)胞體通過(guò)表皮滲透而進(jìn)入小鼠體內(nèi)，但是由于表皮無(wú)血管所以只有微量的豬附紅細(xì)胞體進(jìn)入小鼠體內(nèi)。但皮下組是經(jīng)過(guò)皮下注射而感染的，其感染率與皮膚組相近，感染率為20%，與皮膚組僅差1%，所以皮膚組的感染途徑不容忽視。

豬附紅細(xì)胞體病屬于一種季節(jié)性疾?。?］，多發(fā)性季節(jié)為9、10月份。在不同的季節(jié)致病性強(qiáng)弱也不同［9］。本試驗(yàn)中的各試驗(yàn)組所用的血液樣本采自3月份和6月份，并不是在該病多發(fā)的季節(jié)采取，至于在多發(fā)性季節(jié)采取的血液樣本會(huì)不會(huì)出現(xiàn)與該試驗(yàn)相同的結(jié)果還需要進(jìn)一步的探討。小鼠在感染第18天以后均出現(xiàn)體內(nèi)的豬附紅細(xì)胞體逐漸減少直至第27天完全消失的情況，其原因之一為免疫抑制劑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而失效；其二，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)小鼠的免疫力得到恢復(fù)所導(dǎo)致。

通過(guò)觀察兩次不同劑量的試驗(yàn)所得到的結(jié)果，我們可以看出感染0.2mL／只豬附紅細(xì)胞體的小鼠的感染率明顯低于感染0.5mL／只豬附紅細(xì)胞體的小鼠的感染率，并且出現(xiàn)感染的時(shí)間較后者晚2d，其消亡的時(shí)間則早于后者1d。這可能是由于兩次試驗(yàn)給予小鼠的豬附紅細(xì)胞體的劑量差異所導(dǎo)致，說(shuō)明豬附紅細(xì)胞體劑量不同感染率也不同。

本試驗(yàn)結(jié)果證明，當(dāng)小鼠免疫力低下時(shí)，易感豬附紅細(xì)胞體，并且通過(guò)皮下、皮膚、口服、傷口、呼吸道5種途徑都可感染，這說(shuō)明豬附紅細(xì)胞體在一定條件下會(huì)危害人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此獸醫(yī)工作者、屠宰場(chǎng)工作人員、飼養(yǎng)員等應(yīng)加強(qiáng)自身防護(hù)。本試驗(yàn)為該病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

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