液態(tài)甲醛對雄性小鼠生殖毒性的研究

李亞琳

（渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714000）

甲醛（formaldehyde）是一種無色、有刺激性氣味的 氣體，是重要的化工原料和有機溶劑，廣泛用于制造樹脂、塑料、橡膠、染料和油漆等。由于甲醛揮發(fā)度低，易從家具與裝飾材料中緩慢釋放而污染室內(nèi)空氣，經(jīng)呼吸道進入人體，并對機體健康產(chǎn)生各種危害［1］。室內(nèi)裝修中使用含有污染物的劣質(zhì)建筑裝飾材料，使居民的室內(nèi)空氣也受到了嚴重的污染［2］，而且已成為危害公共健康的重要環(huán)境因素之一。甲醛作為一種常見的裝修型化學性室內(nèi)空氣污染物，以其來源廣，污染水平高，持續(xù)時間長，毒性大，毒害作用種類繁多等特點，受到人們的廣泛關(guān)注，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將甲醛列為A1類化合物——人類致癌物［3］。甲醛對動物染毒的試驗研究表明，甲醛引起的危害是多方面的，如致雄性小鼠的DNA單鏈斷裂、染色體異常、姐妹染色體交換、基因突變、呼吸道和眼部刺激作用、致敏作用和免疫毒性、遺傳毒性［4-5］，并能導致癌癥、肺及肝功能損害、神經(jīng)行為改變等［6-7］。隨著對甲醛的廣泛使用，關(guān)于甲醛污染對人體造成的危害已經(jīng)引起人們的高度重視。

本試驗將采用液態(tài)甲醛染毒的方法，通過給小鼠腹腔注射不同濃度的甲醛溶液，觀察小鼠行為變化，測定小鼠睪丸的臟器系數(shù)、精子總數(shù)、精子存活率，并通過組織切片觀察生殖系統(tǒng)的病理變化，來探討甲醛對成年雄性小鼠生殖系統(tǒng)的毒性效應，為研究甲醛引起的人類疾病提供一定的試驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性小鼠，體重為25g±2g，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，自由飲水和進食。

1.1.2 試劑 生理鹽水，福爾馬林溶液，700、800、950mL／L乙醇，無水乙醇，二甲苯，伊紅，蘇木精，蛋白甘油，鹽酸乙醇，切片石蠟，中性樹膠。

1.1.3 儀器 移液槍，恒溫水浴箱，電子分析天平，切片機，顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 分組 雄性小鼠16只，試驗前先觀察1周，然后隨機分成4組，包括對照組和3個染毒組，每組4只。

1.2.2 染毒方法 在無菌條件下，用生理鹽水配置成不同濃度的甲醛溶液，其濃度分別為2、20、200 mL／kg，臨用時配制。用不同濃度的甲醛溶液腹腔注射染毒，給藥量為每只小鼠0.1mL，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。每天上午10：00注射1次，持續(xù)3周，同時觀察行為變化。

1.2.3 行為的觀察 每日觀察并記錄小鼠的飲食變化，外觀體征，行為活動，糞便性狀。

1.2.4 睪丸臟器系數(shù)的測定 每組小鼠脫頸椎處死后稱其體重，并迅速取出睪丸，用電子天平準確稱重并記錄。計算睪丸臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=睪丸質(zhì)量（mg）／小鼠體重（g）。

1.2.5 精子懸液的制備 頸椎脫臼處死小鼠后，立即取出附睪，用預溫的37℃生理鹽水沖洗2次，用眼科剪縱向剪開附睪，置于加有3mL 37℃的生理鹽水的試管中，在恒溫箱中孵育20min，使精子充分游離。

1.2.6 精子的存活率 取出一定量的精子懸液，與等體積的伊紅迅速充分混勻，使其染色后，取出10μL加入紅細胞記數(shù)板中，400倍鏡下觀察一個視野中的精子存活情況，活細胞染成紅色，死細胞為無色（鏡下觀察為透明）。精子存活率=活精子數(shù)／（活精子數(shù)＋死精子數(shù)）×100%。

1.2.7 生殖系統(tǒng)的病理觀察 睪丸形態(tài)的肉眼觀察：將各組雄性小鼠脫頸椎處死后，取出兩側(cè)睪丸，并觀察顏色及形態(tài)的變化。

精子畸形變化的觀察：按照以上的精子觀察的方法，計數(shù)精子數(shù)量并觀察不同染毒組的小鼠精子的形態(tài)變化。

睪丸組織形態(tài)觀察：將各組雄性小鼠脫頸椎處死后，取睪丸，立即放入100mL／L的福爾馬林溶液中固定，梯度乙醇脫水，透明后常規(guī)石蠟包埋，間斷均勻切片5張～10張，切片厚度為7μm，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 表中數(shù)據(jù)代表4次重復試驗的平均值（±sD），結(jié)果用雙樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 行為的變化

液態(tài)甲醛染毒后可以引起小鼠的食量減少，飲水量減少；初期，小鼠有抓嘴、抓鼻、撓耳朵等行為，隨后小鼠出現(xiàn)高度興奮、躁動不安、站立，攀爬等行為；最后，出現(xiàn)群聚、懶惰、個別的鼠則出現(xiàn)走路拖曳、搖擺等現(xiàn)象，并且高濃度組中有幾只小鼠有毛發(fā)缺少光澤，糞便不成形且變成黃白色等現(xiàn)象。

2.2 睪丸的臟器系數(shù)

由表1表明隨染毒劑量的增加，睪丸的臟器系數(shù)呈降低趨勢。與對照組相比，低劑量（2mg／kg）組具有顯著性差異（P＜0.05），而中劑量（20mg／kg）組與高劑量（200mg／kg）組差異極顯著（P＜0.01）。

表1 甲醛對睪丸臟器系數(shù)的影響Table 1 Effect of formaldehyde on testicle organ coefficient

2.3 精子總數(shù)、存活率

由表2表明隨著染毒劑量的增加，精子總數(shù)逐漸減少，精子存活率逐漸降低。與對照組相比較，低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），而中、高劑量組差異極顯著（P＜0.01）。

表2 甲醛對精子存活率的影響Table 2 Effect of formaldehyde on survive rates of the sperms

2.4 生殖系統(tǒng)的病理觀察變化

2.4.1 精子畸形的觀察 在400倍顯微鏡下觀察精子的頭部、體部和尾部的形態(tài)變化，出現(xiàn)雙頭狀、香蕉狀、無定形狀、肥胖以及雙尾、無尾、尾巴折疊等現(xiàn)象，這些精子均為畸形的精子，并隨染毒劑量的增加，精子畸變程度顯著升高，畸形的精子數(shù)量也逐漸增加。

2.4.2 肉眼觀察 經(jīng)過解剖后，取出兩側(cè)睪丸觀察其顏色變化，對照組的顏色白色而有光澤；低濃度組與對照組接近；而中、高濃度組的顏色泛黃而無光澤，且表面可見紅色的毛細血管。

2.4.3 組織形態(tài)觀察 對照組小白鼠的睪丸生精小管內(nèi)生精細胞豐富，層次分明，發(fā)育正常，管腔內(nèi)有許多精子，分布于支持細胞頂端（圖1A）；低劑量組的各階段生精細胞基本正常，與對照組沒有顯著差異，但有部分細胞稀疏、變性、脫落，個別的小管內(nèi)可見精子出現(xiàn)水腫（圖1B）；中劑量組小鼠睪丸病變進一步加重，出現(xiàn)廣泛性的生精細胞層次稀疏，生精細胞明顯水腫，生精細胞及支持細胞變性、壞死、脫落，小管內(nèi)可見個別變性水腫的精子（圖1C）；高劑量組睪丸生精細胞層崩解減少，生精細胞廣泛脫落，小管內(nèi)生精上皮大多數(shù)水腫或皺縮，個別小管內(nèi)未見精子，僅見殘存的支持細胞（圖1D）。

3 討論

甲醛具有毒性，能對小鼠的生理及行為產(chǎn)生一定的影響，且甲醛溶液的濃度越高，染毒時間越長，其效果越明顯［8-9］。小鼠的行為變化與小鼠機體的生理活動和神經(jīng)支配有密切的聯(lián)系，有試驗已經(jīng)證明，當給小鼠注射甲醛溶液后，溶液滲入機體并對機體產(chǎn)生毒性效應，機體會通過周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)的相互作用而發(fā)出相應的信號，從而支配相應的行為變化［10］。本試驗通過對小鼠腹腔注射甲醛溶液后觀察其行為的變化，染毒后，小鼠的食量、飲水量均減少，由高度興奮、躁動逐漸變?yōu)槿壕?、懶惰，最后出現(xiàn)走路拖曳、搖擺等行為。

甲醛對雄性小鼠的生殖器官有毒害作用，染毒后甲醛進入并作用于睪丸組織，對睪丸的生長及生理活動產(chǎn)生影響，從而造成睪丸組織的病理性變化，造成睪丸萎縮而使臟器系數(shù)降低［11-12］。本試驗研究表明隨著染毒劑量的升高，甲醛對小鼠生殖器官的毒性也增大，睪丸的臟器系數(shù)也變小，說明甲醛使小鼠睪丸發(fā)生了不同程度的萎縮。

成年雄性小鼠的正常精子的產(chǎn)生、分化及成熟有賴于睪丸的生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞之間的密切協(xié)調(diào)，并受到下丘腦-垂體-性腺軸的控制，其中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙時，都會使生殖系統(tǒng)發(fā)生障礙。生精小管（seminiferous tubule）是精子的發(fā)生地，主要由生精上皮構(gòu)成，生精上皮由支持細胞和生精細胞構(gòu)成。成年的雄鼠生精細胞不斷發(fā)育為精子，其順序為精原細胞-初級精母細胞-次級精母細胞-精子細胞-精子。生精細胞沿著生精小管的管腔由內(nèi)向外依次排列，睪丸間質(zhì)是生精小管之間的富含血管的疏松結(jié)締組織，生精小管與血液之間存在血-睪屏障，血睪屏障能阻止某些物質(zhì)進入生精上皮，從而維持精子形成的微環(huán)境，而支持細胞主要為生精過程提供營養(yǎng)、分泌激素等，同時也是生精細胞的附著場所。當給小鼠腹腔注射甲醛溶液時，毒物會通過血液滲入睪丸組織，進而破壞了血-睪屏障，進入生精小管，破壞了生精細胞的正常生長發(fā)育過程，同時，支持細胞的功能也受到了阻礙，從而出現(xiàn)生精細胞層次減少、稀疏、脫落的現(xiàn)象，支持細胞也變性、壞死、脫落，整個過程將影響了精子的發(fā)生，從而使精子數(shù)量減少［13］，并引起睪丸細胞DNA的損傷［14］。本試驗研究表明，經(jīng)過染毒后的小鼠睪丸組織發(fā)生病變，低濃度組的睪丸組織的生精細胞稀疏，中濃度組的變性、壞死、脫落，精子出現(xiàn)水腫，高濃組的壞死、脫落，并且隨著染毒劑量的增大，受損程度更加明顯。

圖1 不同濃度甲醛處理的睪丸組織病理切片觀察（400×）Fig.1 Observation of testicle tissue section treated by different formaldehyde concentrations（400×）

足夠的精子數(shù)量是維持正常生育力的重要前提，在評價有害因素對雄性生殖健康的影響時，精子數(shù)量的改變比其他指標更為敏感。精子計數(shù)是評價生殖毒性效應的重要指標，可反映生精細胞的功能［15］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)甲醛染毒后，隨著染毒劑量的增加，各染毒組的精子數(shù)量、精子存活率均明顯降低，與對照組比較有極顯著性差異，表明甲醛能抑制精子的發(fā)生，干擾精子的形成和生長過程。

目前認為，精子形態(tài)由多基因遺傳控制，常染色體上的基因控制精子畸形的類型，性連鎖基因Y-基因控制畸形精子的數(shù)量，因此，精子畸形率的增加在一定程度上反映出雄性生殖細胞的遺傳損傷。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲醛能使精子畸形的數(shù)目增加，引起嚴重的生殖毒性作用［9，15］。本試驗通過使小鼠染毒，并觀察不同劑量組的精子畸形的變化，表明甲醛溶液染毒后能影響精子的形成及生長發(fā)育過程，使精子發(fā)生不同程度的畸變，并隨染毒劑量的增加，精子畸變程度顯著升高，畸形的精子數(shù)量也逐漸增加。

本研究通過甲醛腹腔注射使小鼠染毒，證明了甲醛能夠滲透并作用于睪丸組織，造成生殖器官萎縮，影響雄性小鼠的生精過程，造成睪丸組織的病理損傷，使精子生成數(shù)目減少，同時對精子的成熟過程造成一定的影響，使精子形態(tài)發(fā)生異常改變，畸變精子數(shù)目增加，直接影響生殖系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮。

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