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    鴨新城疫病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA 方法的初步建立

    2012-08-14 08:01:26孫敏華董嘉文呂殿紅周秀蓉李林林胡奇林
    動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2012年12期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    孫敏華,董嘉文,呂殿紅,周秀蓉,李林林,胡奇林

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 廣東省公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510640)

    新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病。早在1971年,Higgins D A[1]在香港發(fā)現(xiàn)9起鴨新城疫病毒感染的急性病例,并分離出高致病性的NDV。而自2000年后,我國分離鑒定的絕大多數(shù)鴨新城疫病毒對鴨的致死率在50%以上,對雞的致死率可高達(dá)100%[2-4]。其中,部分毒株與水禽新城疫病毒關(guān)系密切[5]。由于NDV宿主范圍廣泛,且目前高致病性毒株所占比例大,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的威脅。

    目前,新城疫的確診主要依靠病毒的分離鑒定,該法準(zhǔn)確、特異,但相對費(fèi)時費(fèi)力。ELISA方法能進(jìn)行批量檢測、速度快,適合于基層獸醫(yī)和動物檢疫部門使用。1995年,吳紅專等研制出新城疫單抗夾心ELISA試劑盒,臨床樣本的檢測結(jié)果表明其陽性符合率達(dá)100%[6]。也建立了針對甲型H1N1流感病毒及鹿流行性出血病病毒的雙抗體夾心ELISA方法[7-8]。鑒于此,本研究制備了抗鴨新城疫病毒單克隆抗體,建立了單抗夾心ELISA方法,為快速診斷鴨新城疫奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞系 1.5kg清潔級新西蘭兔和6周~8周齡Balb/c雌性小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭霄峰教授惠贈。

    1.1.2 試劑 HAT選擇培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;HT培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品;PEG 1450為Sigma公司產(chǎn)品;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Fermentas公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗為Proteintech公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗和弗氏佐劑為鼎國生物有限公司產(chǎn)品;禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品;ELISA反應(yīng)板為Corning公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 抗原的制備 鴨新城疫病毒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室鑒定、保存。經(jīng)尿囊腔接種于12日齡鴨胚,收集24h后死亡的鴨胚尿囊液,經(jīng)差速和蔗糖密度梯度離心純化,測定蛋白含量,保存于-70℃,用作免疫抗原和包被抗原。

    1.2.2 ELISA篩選方法的建立 參照文獻(xiàn)[9]選擇6周齡雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫,采集血清。將Balb/c小鼠陽性血清和陰性血清均作倍比稀釋,同時設(shè)立SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清及空白對照,選擇OD490nm值在1.0左右,P/N比值最大的抗原稀釋濃度為最適工作濃度。

    1.2.3 單克隆抗體及腹水的制備、篩選和鑒定 按照常規(guī)方法融合[9],用ELISA方法篩選陽性克隆,進(jìn)行亞克隆及腹水制備。制備鴨胚成纖維細(xì)胞,參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行單抗中和活性的測定。取細(xì)胞培養(yǎng)上清單克隆抗體,按照 Mouse MAb Isotyping Kit(Hycult Biotech)說明書進(jìn)行亞類鑒定。測定單抗亞類后,用間接ELISA方法測定腹水效價(jià)。

    1.2.4 單克隆抗體的特異性 將傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、禽 呼 腸病毒 (ARV)、鵝 細(xì) 小病毒(GPV)、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨瘟病毒(DPV)、NDV LaSota株、F48E9株尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原按1∶10稀釋后包被ELISA反應(yīng)板,應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行測定。

    1.2.5 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立及其特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 用PEG沉淀法[10]對2C1腹水進(jìn)行純化;用辛酸-硫酸銨沉淀法[11]對兔抗鴨新城疫病毒血清進(jìn)行純化,測定蛋白含量,用SDS-PAGE鑒定純度。分別以純化的單抗和多抗為包被抗體,進(jìn)行雙抗體夾心ELISA,以確定最佳包被抗體。以方陣法確定抗體、抗原最佳工作濃度、作用時間等。特異性試驗(yàn)是以DPMV尿囊液作為陽性對照,正常雞胚、鴨胚尿囊液為陰性對照,對IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 的尿囊液及 H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原進(jìn)行ELISA檢測。敏感性試驗(yàn)是將DPMV尿囊液作1∶5~1∶5 120稀釋,分別測定其血凝活性及ELISA效價(jià),以確定該方法的敏感性。重復(fù)性試驗(yàn)是將DPMV陰、陽性尿囊液分別按1∶10、1∶20稀釋,各做3個重復(fù),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù);在不同時間重復(fù)3次該試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算批間變異系數(shù)。

    1.2.6 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 以雙抗體夾心ELISA方法檢測30份NDV非免疫雞的泄殖腔拭子樣品,根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則,樣本的OD490nm值>陰性樣本OD均值(ˉX)+3×SD時,可以在99.9%的水平上判定為陽性。

    1.2.7 人工感染樣品的檢測 取DPMV尿囊液1∶10稀釋后人工滴鼻感染3只6周齡SPF雞,每只0.2mL。分別于感染后1d~7d,采集對照組和感染雞的泄殖腔拭子于2mL PBS中,擠壓拭子后,5 000r/min離心5min,取0.1mL上清用ELISA方法檢測,同時平行取0.3mL上清用雙抗處理后,接種SPF雞胚制備的成纖維細(xì)胞單層進(jìn)行病毒分離,每份樣品接3孔細(xì)胞,每孔0.1mL。病毒鑒定采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 抗原的制備

    感染鴨胚尿囊液經(jīng)高速離心沉淀,蔗糖密度梯度純化,取出40%~60%之間的白色病毒層,脫糖后,將沉淀溶于3mL PBS中,紫外分光光度計(jì)測得病毒的蛋白含量為6.52mg/mL。

    2.2 單克隆抗體的篩選及其特性測定

    當(dāng)包被的病毒量為0.8μg/孔,陽性鼠血清1∶800稀釋,羊抗鼠二抗1∶10 000倍稀釋時,P/N比值最大,且陽性值最接近1.0。因此,選擇該條件下的抗原包被量和二抗作用濃度來篩選單克隆抗體。細(xì)胞融合后,經(jīng)ELISA篩選,選取P/N>3.0的細(xì)胞孔,用有限稀釋法克隆3次后,獲得一株穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株,命名為2C1。特異性試驗(yàn)表明,2C1不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原發(fā)生交叉反應(yīng),但與新城疫病毒La Sota株、F48E9株尿囊液發(fā)生反應(yīng);中和試驗(yàn)結(jié)果表明,該株單抗沒有中和活性;抗體亞類鑒定表明,該單克隆抗體重鏈為IgM,輕鏈為κ鏈(圖1)。雜交瘤細(xì)胞株2C1所制備的腹水ELISA效價(jià)大于1∶64 000。

    圖1 單克隆抗體2C1亞類鑒定結(jié)果Fig.1 Subtype identification of monoclonal antibody 2C1

    2.3 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

    2C1腹水用120g/L的PEG6000溶液沉淀兩次。兔抗NDV血清經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化、透析、離心后,與純化前的腹水和多克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn),純化后的抗體在凝膠中均呈現(xiàn)出重鏈和輕鏈兩條特異性的條帶,且大小與預(yù)期相符(圖2)。ELISA試驗(yàn)表明,以純化后的2C1腹水作為包被抗體,兔抗DPMV多克隆抗體為第二抗體,其P/N值高,且陰陽性區(qū)別明顯。方陣試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)純化后的單抗包被量為4μg/孔,鴨副黏病毒尿囊液1∶10稀釋,兔抗鴨副黏病毒多克隆抗體濃度為0.1μg/孔,HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗1∶10 000倍稀釋,每種組分作用1h時,P/N值最大,條件最優(yōu)。

    圖2 單抗2C1及抗NDV兔血清純化前后SDS-PAGE電泳比較結(jié)果Fig.2 The comparison of SDS-PAGE results of the unpurified and precipitated monoclonal antibody 2C1and polyclonal antibody against duck NDV

    2.4 雙抗體夾心ELISA方法特異性、敏感性和重復(fù)性的確定

    在最佳工作條件下,IBV、ARV、GPV、DHV、DPV的尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原的OD490nm值最高為0.122,與陰性對照的比值小于2,特異性良好(表1)。倍比稀釋后的尿囊液HA效價(jià)為1∶10,ELISA效價(jià)(按P/N>3.0計(jì)算)為1∶640,因此判定ELISA方法敏感性至少比HA高64倍(表2)。純化的鴨副黏病毒稀釋后,ELISA至少可以檢測到0.2μg的病毒(表3)。重復(fù)性試驗(yàn)表明,兩個稀釋度抗原的批間重復(fù)變異系數(shù)為5.22%~9.15%,批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)為2.03%~5.34%。

    2.5 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

    30份未免疫新城疫疫苗的雞泄殖腔拭子ELISA檢測平均OD值為0.130,標(biāo)準(zhǔn)差為0.038,計(jì)算可得,當(dāng)樣品的OD490nm值大于0.244時,可判定為陽性。

    2.6 人工感染樣品的檢測結(jié)果

    根據(jù)ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定,1號雞第4天和第5天拭子檢測結(jié)果為陽性;2號雞無陽性結(jié)果;3號雞攻毒后第3、第4、第5天檢測結(jié)果陽性。這些ELISA陽性檢測結(jié)果中,1號和2號的檢測結(jié)果與病毒分離相符合,而第3號雞攻毒后的第3天和第6天檢測結(jié)果與病毒分離不符。綜合計(jì)算,ELISA檢測結(jié)果與病毒分離的總符合率為91.7%(表4)。

    表1 雙抗體夾心ELISA特異性檢測結(jié)果Table 1 The specificity of the sandwich ELISA

    表2 HA和雙抗體夾心ELISA檢測鴨新城疫病毒結(jié)果比較Table 2 The results of HA test and the sandwich ELISA for detecting the duck NDV

    表3 雙抗體夾心ELISA方法敏感性試驗(yàn)Table 3 The sensitivity of the sandwich ELISA

    表4 人工感染樣品ELISA檢測結(jié)果Table 4 The detective results of experimentally infected chickens by sandwich ELISA

    3 討論

    本研究采用蔗糖密度梯度離心法純化了鴨新城疫病毒,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得了一株抗鴨新城疫病毒單克隆抗體2C1的雜交瘤細(xì)胞株。單抗篩選采用了全病毒包被的間接ELISA方法,擴(kuò)大了篩選范圍。2C1經(jīng)中和試驗(yàn)后,發(fā)現(xiàn)其不具有中和活性,因此在后續(xù)制備具有中和活性的單抗時用HI試驗(yàn)篩選可能會獲得理想的結(jié)果。經(jīng)ELISA檢測,2C1腹水的ELISA效價(jià)大于1:64 000,且與其他禽類病毒無交叉反應(yīng),證明其特異性良好,可以用于后續(xù)夾心ELISA方法的建立。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明2C1的重鏈為IgM。由于IgM通常以五聚體的形式存在,且容易聚集,在高鹽和低鹽溶液中溶解度都不高,因此純化方法有別于IgG。Mahassni S H等[13]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗牛凝血素的小鼠IgM單抗最佳的純化方法是離子交換層析,而腹水中的最佳純化方法是G-100凝膠過濾。曹軍平等[10]研究發(fā)現(xiàn)利用PEG6000沉淀法純化的單抗較純凈,且活性損失少。綜合成本和時間因素,本研究選用PEG沉淀法進(jìn)行2C1腹水的純化。而鴨新城疫病毒多克隆抗體的純化,本研究參考 McKinney M M 等[11]和曹軍平等[10]的研究,選擇了辛酸-硫酸銨法進(jìn)行了純化。對純化前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE(圖2),結(jié)果顯示純化效果良好,去除了雜蛋白,且重鏈和輕鏈分子量大小符合預(yù)期。

    在選擇夾心ELISA中的包被抗體時,用純化后的腹水2C1和純化的鴨新城疫病毒多克隆抗體分別包被酶標(biāo)板,進(jìn)行ELISA預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)2C1作為包被抗體,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作為第二抗體時,才能獲得較高的P/N值。方陣試驗(yàn)表明,當(dāng)2C1包被濃度為4μg/孔,鴨新城疫病毒尿囊液1∶10稀釋,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作用濃度為0.1μg/孔,HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體1∶10 000倍稀釋,每種成分作用1h時,P/N比值最高。特異性試驗(yàn)表明所建立的鴨新城疫病毒檢測方法不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 發(fā)生交叉反應(yīng)。該ELISA方法比傳統(tǒng)HA試驗(yàn)方法至少敏感64倍,可以檢測出0.2μg的純化病毒。吳紅專等[6]研 制 的 PEG-ELISA 試 劑 盒 的 敏 感 性 為0.25ng~0.5ng的純化病毒,比本研究的結(jié)果高出800倍,這可能與單抗親和力及PEG具有沉淀免疫復(fù)合物的作用有關(guān)。因此,高親和力的單抗是試劑盒研制成功的關(guān)鍵。

    小樣本人工感染樣本檢測結(jié)果表明,本研究所建立的夾心ELISA方法與病毒分離的符合率為91.7%。由于所取樣本有限,后續(xù)試驗(yàn)需擴(kuò)大樣本檢測數(shù)量,以便評價(jià)本研究建立方法的實(shí)用性。ELISA和病毒分離的結(jié)果表明,感染后的SPF雞排毒高峰在3d~5d,這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)類似[14]。由于雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)中參與反應(yīng)的成分多,非特異性反應(yīng)很難完全消除。本研究在檢測含大量糞便的拭子時,ELISA檢測結(jié)果存在偏高的現(xiàn)象,其原因尚待進(jìn)一步研究。目前,能夠進(jìn)行鑒別診斷的單抗夾心ELISA方法尚不多見[6,15],且 ELISA 呈陽性者不全是強(qiáng)毒力株,還有中等毒毒力株或弱毒力株[16]。因此,鑒別診斷ELISA方法是今后研究的重點(diǎn)。

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