• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鴨新城疫病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA 方法的初步建立

    2012-08-14 08:01:26孫敏華董嘉文呂殿紅周秀蓉李林林胡奇林
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

    孫敏華,董嘉文,呂殿紅,周秀蓉,李林林,胡奇林

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 廣東省公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510640)

    新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病。早在1971年,Higgins D A[1]在香港發(fā)現(xiàn)9起鴨新城疫病毒感染的急性病例,并分離出高致病性的NDV。而自2000年后,我國分離鑒定的絕大多數(shù)鴨新城疫病毒對(duì)鴨的致死率在50%以上,對(duì)雞的致死率可高達(dá)100%[2-4]。其中,部分毒株與水禽新城疫病毒關(guān)系密切[5]。由于NDV宿主范圍廣泛,且目前高致病性毒株所占比例大,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的威脅。

    目前,新城疫的確診主要依靠病毒的分離鑒定,該法準(zhǔn)確、特異,但相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。ELISA方法能進(jìn)行批量檢測(cè)、速度快,適合于基層獸醫(yī)和動(dòng)物檢疫部門使用。1995年,吳紅專等研制出新城疫單抗夾心ELISA試劑盒,臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果表明其陽性符合率達(dá)100%[6]。也建立了針對(duì)甲型H1N1流感病毒及鹿流行性出血病病毒的雙抗體夾心ELISA方法[7-8]。鑒于此,本研究制備了抗鴨新城疫病毒單克隆抗體,建立了單抗夾心ELISA方法,為快速診斷鴨新城疫奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系 1.5kg清潔級(jí)新西蘭兔和6周~8周齡Balb/c雌性小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭霄峰教授惠贈(zèng)。

    1.1.2 試劑 HAT選擇培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;HT培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品;PEG 1450為Sigma公司產(chǎn)品;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Fermentas公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗為Proteintech公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗和弗氏佐劑為鼎國生物有限公司產(chǎn)品;禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品;ELISA反應(yīng)板為Corning公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 抗原的制備 鴨新城疫病毒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室鑒定、保存。經(jīng)尿囊腔接種于12日齡鴨胚,收集24h后死亡的鴨胚尿囊液,經(jīng)差速和蔗糖密度梯度離心純化,測(cè)定蛋白含量,保存于-70℃,用作免疫抗原和包被抗原。

    1.2.2 ELISA篩選方法的建立 參照文獻(xiàn)[9]選擇6周齡雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫,采集血清。將Balb/c小鼠陽性血清和陰性血清均作倍比稀釋,同時(shí)設(shè)立SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清及空白對(duì)照,選擇OD490nm值在1.0左右,P/N比值最大的抗原稀釋濃度為最適工作濃度。

    1.2.3 單克隆抗體及腹水的制備、篩選和鑒定 按照常規(guī)方法融合[9],用ELISA方法篩選陽性克隆,進(jìn)行亞克隆及腹水制備。制備鴨胚成纖維細(xì)胞,參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行單抗中和活性的測(cè)定。取細(xì)胞培養(yǎng)上清單克隆抗體,按照 Mouse MAb Isotyping Kit(Hycult Biotech)說明書進(jìn)行亞類鑒定。測(cè)定單抗亞類后,用間接ELISA方法測(cè)定腹水效價(jià)。

    1.2.4 單克隆抗體的特異性 將傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、禽 呼 腸病毒 (ARV)、鵝 細(xì) 小病毒(GPV)、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨瘟病毒(DPV)、NDV LaSota株、F48E9株尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原按1∶10稀釋后包被ELISA反應(yīng)板,應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.5 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立及其特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 用PEG沉淀法[10]對(duì)2C1腹水進(jìn)行純化;用辛酸-硫酸銨沉淀法[11]對(duì)兔抗鴨新城疫病毒血清進(jìn)行純化,測(cè)定蛋白含量,用SDS-PAGE鑒定純度。分別以純化的單抗和多抗為包被抗體,進(jìn)行雙抗體夾心ELISA,以確定最佳包被抗體。以方陣法確定抗體、抗原最佳工作濃度、作用時(shí)間等。特異性試驗(yàn)是以DPMV尿囊液作為陽性對(duì)照,正常雞胚、鴨胚尿囊液為陰性對(duì)照,對(duì)IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 的尿囊液及 H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)。敏感性試驗(yàn)是將DPMV尿囊液作1∶5~1∶5 120稀釋,分別測(cè)定其血凝活性及ELISA效價(jià),以確定該方法的敏感性。重復(fù)性試驗(yàn)是將DPMV陰、陽性尿囊液分別按1∶10、1∶20稀釋,各做3個(gè)重復(fù),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù);在不同時(shí)間重復(fù)3次該試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算批間變異系數(shù)。

    1.2.6 雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)臨床樣品時(shí)陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 以雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)30份NDV非免疫雞的泄殖腔拭子樣品,根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則,樣本的OD490nm值>陰性樣本OD均值(ˉX)+3×SD時(shí),可以在99.9%的水平上判定為陽性。

    1.2.7 人工感染樣品的檢測(cè) 取DPMV尿囊液1∶10稀釋后人工滴鼻感染3只6周齡SPF雞,每只0.2mL。分別于感染后1d~7d,采集對(duì)照組和感染雞的泄殖腔拭子于2mL PBS中,擠壓拭子后,5 000r/min離心5min,取0.1mL上清用ELISA方法檢測(cè),同時(shí)平行取0.3mL上清用雙抗處理后,接種SPF雞胚制備的成纖維細(xì)胞單層進(jìn)行病毒分離,每份樣品接3孔細(xì)胞,每孔0.1mL。病毒鑒定采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 抗原的制備

    感染鴨胚尿囊液經(jīng)高速離心沉淀,蔗糖密度梯度純化,取出40%~60%之間的白色病毒層,脫糖后,將沉淀溶于3mL PBS中,紫外分光光度計(jì)測(cè)得病毒的蛋白含量為6.52mg/mL。

    2.2 單克隆抗體的篩選及其特性測(cè)定

    當(dāng)包被的病毒量為0.8μg/孔,陽性鼠血清1∶800稀釋,羊抗鼠二抗1∶10 000倍稀釋時(shí),P/N比值最大,且陽性值最接近1.0。因此,選擇該條件下的抗原包被量和二抗作用濃度來篩選單克隆抗體。細(xì)胞融合后,經(jīng)ELISA篩選,選取P/N>3.0的細(xì)胞孔,用有限稀釋法克隆3次后,獲得一株穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株,命名為2C1。特異性試驗(yàn)表明,2C1不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原發(fā)生交叉反應(yīng),但與新城疫病毒La Sota株、F48E9株尿囊液發(fā)生反應(yīng);中和試驗(yàn)結(jié)果表明,該株單抗沒有中和活性;抗體亞類鑒定表明,該單克隆抗體重鏈為IgM,輕鏈為κ鏈(圖1)。雜交瘤細(xì)胞株2C1所制備的腹水ELISA效價(jià)大于1∶64 000。

    圖1 單克隆抗體2C1亞類鑒定結(jié)果Fig.1 Subtype identification of monoclonal antibody 2C1

    2.3 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

    2C1腹水用120g/L的PEG6000溶液沉淀兩次。兔抗NDV血清經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化、透析、離心后,與純化前的腹水和多克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn),純化后的抗體在凝膠中均呈現(xiàn)出重鏈和輕鏈兩條特異性的條帶,且大小與預(yù)期相符(圖2)。ELISA試驗(yàn)表明,以純化后的2C1腹水作為包被抗體,兔抗DPMV多克隆抗體為第二抗體,其P/N值高,且陰陽性區(qū)別明顯。方陣試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)純化后的單抗包被量為4μg/孔,鴨副黏病毒尿囊液1∶10稀釋,兔抗鴨副黏病毒多克隆抗體濃度為0.1μg/孔,HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗1∶10 000倍稀釋,每種組分作用1h時(shí),P/N值最大,條件最優(yōu)。

    圖2 單抗2C1及抗NDV兔血清純化前后SDS-PAGE電泳比較結(jié)果Fig.2 The comparison of SDS-PAGE results of the unpurified and precipitated monoclonal antibody 2C1and polyclonal antibody against duck NDV

    2.4 雙抗體夾心ELISA方法特異性、敏感性和重復(fù)性的確定

    在最佳工作條件下,IBV、ARV、GPV、DHV、DPV的尿囊液以及禽流感H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原的OD490nm值最高為0.122,與陰性對(duì)照的比值小于2,特異性良好(表1)。倍比稀釋后的尿囊液HA效價(jià)為1∶10,ELISA效價(jià)(按P/N>3.0計(jì)算)為1∶640,因此判定ELISA方法敏感性至少比HA高64倍(表2)。純化的鴨副黏病毒稀釋后,ELISA至少可以檢測(cè)到0.2μg的病毒(表3)。重復(fù)性試驗(yàn)表明,兩個(gè)稀釋度抗原的批間重復(fù)變異系數(shù)為5.22%~9.15%,批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)為2.03%~5.34%。

    2.5 雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)臨床樣品時(shí)陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

    30份未免疫新城疫疫苗的雞泄殖腔拭子ELISA檢測(cè)平均OD值為0.130,標(biāo)準(zhǔn)差為0.038,計(jì)算可得,當(dāng)樣品的OD490nm值大于0.244時(shí),可判定為陽性。

    2.6 人工感染樣品的檢測(cè)結(jié)果

    根據(jù)ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)判定,1號(hào)雞第4天和第5天拭子檢測(cè)結(jié)果為陽性;2號(hào)雞無陽性結(jié)果;3號(hào)雞攻毒后第3、第4、第5天檢測(cè)結(jié)果陽性。這些ELISA陽性檢測(cè)結(jié)果中,1號(hào)和2號(hào)的檢測(cè)結(jié)果與病毒分離相符合,而第3號(hào)雞攻毒后的第3天和第6天檢測(cè)結(jié)果與病毒分離不符。綜合計(jì)算,ELISA檢測(cè)結(jié)果與病毒分離的總符合率為91.7%(表4)。

    表1 雙抗體夾心ELISA特異性檢測(cè)結(jié)果Table 1 The specificity of the sandwich ELISA

    表2 HA和雙抗體夾心ELISA檢測(cè)鴨新城疫病毒結(jié)果比較Table 2 The results of HA test and the sandwich ELISA for detecting the duck NDV

    表3 雙抗體夾心ELISA方法敏感性試驗(yàn)Table 3 The sensitivity of the sandwich ELISA

    表4 人工感染樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 4 The detective results of experimentally infected chickens by sandwich ELISA

    3 討論

    本研究采用蔗糖密度梯度離心法純化了鴨新城疫病毒,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得了一株抗鴨新城疫病毒單克隆抗體2C1的雜交瘤細(xì)胞株。單抗篩選采用了全病毒包被的間接ELISA方法,擴(kuò)大了篩選范圍。2C1經(jīng)中和試驗(yàn)后,發(fā)現(xiàn)其不具有中和活性,因此在后續(xù)制備具有中和活性的單抗時(shí)用HI試驗(yàn)篩選可能會(huì)獲得理想的結(jié)果。經(jīng)ELISA檢測(cè),2C1腹水的ELISA效價(jià)大于1:64 000,且與其他禽類病毒無交叉反應(yīng),證明其特異性良好,可以用于后續(xù)夾心ELISA方法的建立。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明2C1的重鏈為IgM。由于IgM通常以五聚體的形式存在,且容易聚集,在高鹽和低鹽溶液中溶解度都不高,因此純化方法有別于IgG。Mahassni S H等[13]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗牛凝血素的小鼠IgM單抗最佳的純化方法是離子交換層析,而腹水中的最佳純化方法是G-100凝膠過濾。曹軍平等[10]研究發(fā)現(xiàn)利用PEG6000沉淀法純化的單抗較純凈,且活性損失少。綜合成本和時(shí)間因素,本研究選用PEG沉淀法進(jìn)行2C1腹水的純化。而鴨新城疫病毒多克隆抗體的純化,本研究參考 McKinney M M 等[11]和曹軍平等[10]的研究,選擇了辛酸-硫酸銨法進(jìn)行了純化。對(duì)純化前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE(圖2),結(jié)果顯示純化效果良好,去除了雜蛋白,且重鏈和輕鏈分子量大小符合預(yù)期。

    在選擇夾心ELISA中的包被抗體時(shí),用純化后的腹水2C1和純化的鴨新城疫病毒多克隆抗體分別包被酶標(biāo)板,進(jìn)行ELISA預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)2C1作為包被抗體,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作為第二抗體時(shí),才能獲得較高的P/N值。方陣試驗(yàn)表明,當(dāng)2C1包被濃度為4μg/孔,鴨新城疫病毒尿囊液1∶10稀釋,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作用濃度為0.1μg/孔,HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體1∶10 000倍稀釋,每種成分作用1h時(shí),P/N比值最高。特異性試驗(yàn)表明所建立的鴨新城疫病毒檢測(cè)方法不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 發(fā)生交叉反應(yīng)。該ELISA方法比傳統(tǒng)HA試驗(yàn)方法至少敏感64倍,可以檢測(cè)出0.2μg的純化病毒。吳紅專等[6]研 制 的 PEG-ELISA 試 劑 盒 的 敏 感 性 為0.25ng~0.5ng的純化病毒,比本研究的結(jié)果高出800倍,這可能與單抗親和力及PEG具有沉淀免疫復(fù)合物的作用有關(guān)。因此,高親和力的單抗是試劑盒研制成功的關(guān)鍵。

    小樣本人工感染樣本檢測(cè)結(jié)果表明,本研究所建立的夾心ELISA方法與病毒分離的符合率為91.7%。由于所取樣本有限,后續(xù)試驗(yàn)需擴(kuò)大樣本檢測(cè)數(shù)量,以便評(píng)價(jià)本研究建立方法的實(shí)用性。ELISA和病毒分離的結(jié)果表明,感染后的SPF雞排毒高峰在3d~5d,這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)類似[14]。由于雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)中參與反應(yīng)的成分多,非特異性反應(yīng)很難完全消除。本研究在檢測(cè)含大量糞便的拭子時(shí),ELISA檢測(cè)結(jié)果存在偏高的現(xiàn)象,其原因尚待進(jìn)一步研究。目前,能夠進(jìn)行鑒別診斷的單抗夾心ELISA方法尚不多見[6,15],且 ELISA 呈陽性者不全是強(qiáng)毒力株,還有中等毒毒力株或弱毒力株[16]。因此,鑒別診斷ELISA方法是今后研究的重點(diǎn)。

    [1] Higgins D A.Nine disease outbreak associated with myxoviruses among ducks in Hongkong[J].Trop Anim Health Prod,1971,5:232-240

    [2] 張訓(xùn)海,朱鴻飛,陳溥言,等.鴨副粘病毒強(qiáng)毒株的分離和鑒定[J].中國動(dòng)物檢疫,2001,18(10):24-26.

    [3] 陳少鶯,胡奇林,陳仕龍,等.鴨副粘病毒的分離與初步鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,26(2):118-120.

    [4] 王耀邦,樓忠寶.番鴨副粘病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷與病毒分離鑒定[J].浙江畜牧獸醫(yī),2008(3):30-31.

    [5] 張青嫻,李 銀,張敬峰,等.鴨源副粘病毒Y03株F基因的克隆及序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,22(4):421-424.

    [6] 吳紅專,張如寬,劉秀梵.新城疫單抗ELISA試劑盒的研制及其初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技,1995,26(5):3-6.

    [7] 王云龍,周春峰,孫新城,等.甲型H1N1流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的初步建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(8):37-41

    [8] 陳 兵,李健波,楊俊興,等.鹿流行性出血病病毒雙抗夾心ELISA方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(10):1-5.

    [9] 殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué) [M].北京:科學(xué)出版社,1997:744.

    [10] 曹軍平,閆桂玲,劉秀梵,等.兩種簡(jiǎn)易高效的單克隆抗體提純方法[J].單克隆抗體通訊,1995,11(2):52-54.

    [11] McKinney M M ,Parkinson A.A simple,non-chromato-graphic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid[J].J Immunol Meth,1987,96(2):271-278.

    [12] 張姝慧.禽流感病毒H5、H9亞型單抗及ELISA鑒別診斷方法的研究和應(yīng)用[D].湖北武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

    [13] Mahassni S H,Klapper D G ,Hiskey R G.Purification of a murine IgM monoclonal antibody[J].Hybridoma,2009,28(3):189-197.

    [14] 張?zhí)?,張金玲,田國寧,?鴨群感染禽副粘病毒后的排毒規(guī)律[J].中國動(dòng)物檢疫,2008,25(9):39-40.

    [15] 陳昌海,張如寬,劉秀梵.用單抗夾心ELISA自免疫雞群檢測(cè)新城疫強(qiáng)毒[J].中國畜禽傳染病,1993(4):28-31.

    [16] 蔣鳳英,胡建華,倪建平,等.單抗夾心ELISA檢測(cè)免疫雞群新城疫病毒[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2002,22(3):286-289.

    猜你喜歡
    檢測(cè)方法
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    學(xué)習(xí)方法
    可能是方法不對(duì)
    小波變換在PCB缺陷檢測(cè)中的應(yīng)用
    用對(duì)方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    国产一区二区在线av高清观看| 中文资源天堂在线| 99久国产av精品| 简卡轻食公司| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 色视频www国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产高清三级在线| 久久久久久久久中文| 婷婷精品国产亚洲av| 两个人的视频大全免费| 不卡一级毛片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久亚洲精品不卡| 一区二区三区高清视频在线| 神马国产精品三级电影在线观看| eeuss影院久久| 十八禁网站免费在线| 久久久久久大精品| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久久大精品| 亚洲av美国av| 欧美黑人欧美精品刺激| 91av网一区二区| 日本五十路高清| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人av一区二区三区在线看| 国产毛片a区久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 在线播放无遮挡| 午夜视频国产福利| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品永久免费网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 18+在线观看网站| 国产伦在线观看视频一区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品野战在线观看| 91狼人影院| av福利片在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲第一电影网av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99久久精品一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产色婷婷99| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久久大精品| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品久久国产蜜桃| 日韩有码中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲精品色激情综合| 日韩欧美精品免费久久 | 国产高清视频在线观看网站| 久久性视频一级片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av福利片在线观看| 丰满的人妻完整版| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜久久久久精精品| 波野结衣二区三区在线| 欧美午夜高清在线| 久久性视频一级片| 看黄色毛片网站| 97碰自拍视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产真实乱freesex| 观看免费一级毛片| 国产精品人妻久久久久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 欧美成人性av电影在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产亚洲精品av在线| .国产精品久久| 两个人的视频大全免费| 丁香欧美五月| or卡值多少钱| 久久久国产成人免费| 精品久久久久久成人av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产午夜精品论理片| 九九在线视频观看精品| 国产三级中文精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久久国产a免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久99热这里只有精品18| 国产精品,欧美在线| 黄色视频,在线免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费看a级黄色片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精华一区二区三区| 看免费av毛片| 精品久久久久久,| 偷拍熟女少妇极品色| aaaaa片日本免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美成人a在线观看| 国产精品永久免费网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产一区二区激情短视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 91麻豆av在线| 国产精品电影一区二区三区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久中文看片网| 欧美在线一区亚洲| 夜夜夜夜夜久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 色5月婷婷丁香| 动漫黄色视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 乱人视频在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 三级国产精品欧美在线观看| 免费av毛片视频| 日本免费a在线| 很黄的视频免费| 黄色丝袜av网址大全| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲专区中文字幕在线| 草草在线视频免费看| 免费看美女性在线毛片视频| 好男人在线观看高清免费视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 色视频www国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线播放无遮挡| 全区人妻精品视频| 美女免费视频网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 日本一二三区视频观看| 美女高潮的动态| 看免费av毛片| 国产黄片美女视频| 两个人的视频大全免费| 香蕉av资源在线| 淫秽高清视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 午夜免费激情av| 亚洲欧美精品综合久久99| 搡老熟女国产l中国老女人| av在线蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 久久久精品欧美日韩精品| 国产真实乱freesex| 亚洲人成网站在线播| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| avwww免费| 亚洲专区中文字幕在线| 免费av毛片视频| 夜夜爽天天搞| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产高清三级在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲美女视频黄频| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲人成电影免费在线| 国产色婷婷99| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产精品成人综合色| 美女cb高潮喷水在线观看| 级片在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 制服丝袜大香蕉在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产野战对白在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜久久久久精精品| 在线天堂最新版资源| 一进一出好大好爽视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 757午夜福利合集在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久成人av| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品影院久久| 久久精品综合一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 免费高清视频大片| 欧美性猛交黑人性爽| 最近中文字幕高清免费大全6 | 色播亚洲综合网| 国产成人av教育| 国产精品亚洲美女久久久| 不卡一级毛片| www.999成人在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 天堂网av新在线| 在线观看免费视频日本深夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中国美女看黄片| 天堂影院成人在线观看| 小说图片视频综合网站| 草草在线视频免费看| 18美女黄网站色大片免费观看| 老女人水多毛片| 99视频精品全部免费 在线| 久久亚洲精品不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲第一电影网av| 亚洲色图av天堂| 日本与韩国留学比较| 欧美精品国产亚洲| 成年人黄色毛片网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国内精品美女久久久久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成伊人成综合网2020| 看片在线看免费视频| 亚洲成人久久性| 色哟哟·www| 亚洲av不卡在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲欧美日韩高清专用| 网址你懂的国产日韩在线| 中文字幕熟女人妻在线| 国产av麻豆久久久久久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情欧美在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线观看舔阴道视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 91狼人影院| 一a级毛片在线观看| 国产av不卡久久| 丝袜美腿在线中文| 真实男女啪啪啪动态图| 人妻夜夜爽99麻豆av| 床上黄色一级片| 国产人妻一区二区三区在| 婷婷丁香在线五月| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99久国产av精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 99在线人妻在线中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 女同久久另类99精品国产91| 久久精品综合一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 免费av毛片视频| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 性色av乱码一区二区三区2| 又爽又黄无遮挡网站| 如何舔出高潮| 极品教师在线视频| 国产成人欧美在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩有码中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| av视频在线观看入口| 嫩草影院新地址| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产免费av片在线观看野外av| 美女大奶头视频| 精品人妻视频免费看| av中文乱码字幕在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美日韩黄片免| 欧美区成人在线视频| 日本成人三级电影网站| 看十八女毛片水多多多| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产探花极品一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 人人妻人人看人人澡| 成人欧美大片| 国产精品永久免费网站| 高清在线国产一区| 国产v大片淫在线免费观看| 性欧美人与动物交配| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 老司机午夜十八禁免费视频| 成年人黄色毛片网站| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 免费在线观看影片大全网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 麻豆成人av在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 免费黄网站久久成人精品 | 久久午夜福利片| 国产真实乱freesex| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国内精品美女久久久久久| www.色视频.com| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 伦理电影大哥的女人| 日本 av在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 波多野结衣高清作品| 欧美性猛交黑人性爽| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 天堂网av新在线| 国产在线男女| 特级一级黄色大片| 婷婷精品国产亚洲av| 女同久久另类99精品国产91| 不卡一级毛片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲自拍偷在线| 久久久精品欧美日韩精品| 又爽又黄a免费视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 超碰av人人做人人爽久久| 熟女人妻精品中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本熟妇午夜| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美成人免费av一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 一进一出好大好爽视频| 亚洲成人久久爱视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品伦人一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美乱色亚洲激情| 少妇高潮的动态图| 一区二区三区激情视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 美女大奶头视频| 97超视频在线观看视频| av在线天堂中文字幕| 夜夜爽天天搞| 可以在线观看的亚洲视频| 性欧美人与动物交配| 最近最新中文字幕大全电影3| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲最大成人中文| 久久国产精品影院| 国产在线男女| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜a级毛片| 综合色av麻豆| 很黄的视频免费| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 色视频www国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产免费男女视频| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av美国av| 免费看美女性在线毛片视频| 毛片女人毛片| 国产成人欧美在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲 国产 在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| or卡值多少钱| 欧美乱妇无乱码| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲第一区二区三区不卡| 乱人视频在线观看| 怎么达到女性高潮| 国产高清视频在线播放一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品久久电影中文字幕| 国产av在哪里看| 黄色视频,在线免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 悠悠久久av| 十八禁网站免费在线| 精品无人区乱码1区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | bbb黄色大片| 一本精品99久久精品77| 久久久久久久久久成人| 韩国av一区二区三区四区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 黄片小视频在线播放| 欧美在线一区亚洲| 51国产日韩欧美| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 深夜精品福利| 中国美女看黄片| 首页视频小说图片口味搜索| 国产av麻豆久久久久久久| 在线天堂最新版资源| 久久亚洲精品不卡| 天美传媒精品一区二区| 国产中年淑女户外野战色| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品99久久久久久久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品不卡视频一区二区 | 成年女人看的毛片在线观看| 国产老妇女一区| 亚洲美女视频黄频| 日本a在线网址| 一级黄片播放器| 午夜精品一区二区三区免费看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜影院日韩av| 精品久久国产蜜桃| 欧美成人一区二区免费高清观看| 美女高潮的动态| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产综合懂色| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲内射少妇av| 日韩有码中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 99热只有精品国产| 久久九九热精品免费| 天堂网av新在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一本一本综合久久| 怎么达到女性高潮| 久久久久久九九精品二区国产| 免费大片18禁| 免费av观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人国产一区最新在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 日本黄大片高清| 男女视频在线观看网站免费| av专区在线播放| 黄色女人牲交| 国产视频内射| 全区人妻精品视频| 国产黄色小视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩av在线大香蕉| 老女人水多毛片| ponron亚洲| 亚洲最大成人av| 特大巨黑吊av在线直播| av福利片在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| bbb黄色大片| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 亚洲欧美清纯卡通| 丁香六月欧美| 亚洲真实伦在线观看| 成人午夜高清在线视频| av黄色大香蕉| 日韩免费av在线播放| 免费观看人在逋| 国产av一区在线观看免费| 精品国产亚洲在线| 久久久久久大精品| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 十八禁网站免费在线| 在线看三级毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产私拍福利视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 成人永久免费在线观看视频| 国产高清激情床上av| 在线观看一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品日韩av片在线观看| 俺也久久电影网| 成人一区二区视频在线观看| 精品久久久久久,| 99riav亚洲国产免费| 少妇的逼水好多| 美女免费视频网站| 97热精品久久久久久| 成人欧美大片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲综合色惰| 三级毛片av免费| 国产毛片a区久久久久| 久久精品影院6| 极品教师在线视频| 国产精品一区二区性色av| 天美传媒精品一区二区| 日本一本二区三区精品| 午夜福利18| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品一区av在线观看| 免费看日本二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人一区二区视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 最近视频中文字幕2019在线8| 国产av一区在线观看免费| av天堂在线播放| 日本一二三区视频观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费在线观看亚洲国产| 国产乱人视频| av女优亚洲男人天堂| av在线蜜桃| 精品欧美国产一区二区三| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美黑人巨大hd| 看十八女毛片水多多多| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩欧美免费精品| 久久久久久久久中文| 久久久久久久久大av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精华国产精华精| 在线观看舔阴道视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲avbb在线观看| 97碰自拍视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美性感艳星| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费av毛片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜免费成人在线视频| 麻豆国产av国片精品| 欧美区成人在线视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久午夜电影| 久久久精品大字幕| 一进一出好大好爽视频| 色av中文字幕| 精品一区二区免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 97超视频在线观看视频| 丁香六月欧美| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产精品合色在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品不卡国产一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 免费在线观看影片大全网站| 久99久视频精品免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线看三级毛片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久精品国产清高在天天线|