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    鴨新城疫病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA 方法的初步建立

    2012-08-14 08:01:26孫敏華董嘉文呂殿紅周秀蓉李林林胡奇林
    動物醫(yī)學進展 2012年12期
    關鍵詞:檢測方法

    孫敏華,董嘉文,呂殿紅,周秀蓉,李林林,胡奇林

    (廣東省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 廣東省公共衛(wèi)生公共實驗室,廣東廣州510640)

    新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病。早在1971年,Higgins D A[1]在香港發(fā)現9起鴨新城疫病毒感染的急性病例,并分離出高致病性的NDV。而自2000年后,我國分離鑒定的絕大多數鴨新城疫病毒對鴨的致死率在50%以上,對雞的致死率可高達100%[2-4]。其中,部分毒株與水禽新城疫病毒關系密切[5]。由于NDV宿主范圍廣泛,且目前高致病性毒株所占比例大,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的威脅。

    目前,新城疫的確診主要依靠病毒的分離鑒定,該法準確、特異,但相對費時費力。ELISA方法能進行批量檢測、速度快,適合于基層獸醫(yī)和動物檢疫部門使用。1995年,吳紅專等研制出新城疫單抗夾心ELISA試劑盒,臨床樣本的檢測結果表明其陽性符合率達100%[6]。也建立了針對甲型H1N1流感病毒及鹿流行性出血病病毒的雙抗體夾心ELISA方法[7-8]。鑒于此,本研究制備了抗鴨新城疫病毒單克隆抗體,建立了單抗夾心ELISA方法,為快速診斷鴨新城疫奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物及細胞系 1.5kg清潔級新西蘭兔和6周~8周齡Balb/c雌性小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心,骨髓瘤細胞SP2/0由華南農業(yè)大學郭霄峰教授惠贈。

    1.1.2 試劑 HAT選擇培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產品;HT培養(yǎng)基為Invitrogen公司產品;PEG 1450為Sigma公司產品;蛋白分子量標準Fermentas公司產品;胎牛血清為杭州四季青生物有限公司產品;HRP標記的羊抗鼠二抗為Proteintech公司產品;HRP標記的羊抗兔二抗和弗氏佐劑為鼎國生物有限公司產品;禽流感H5、H9標準陽性抗原為哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司產品;ELISA反應板為Corning公司產品。

    1.2 方法

    1.2.1 抗原的制備 鴨新城疫病毒由廣東省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所禽病研究室鑒定、保存。經尿囊腔接種于12日齡鴨胚,收集24h后死亡的鴨胚尿囊液,經差速和蔗糖密度梯度離心純化,測定蛋白含量,保存于-70℃,用作免疫抗原和包被抗原。

    1.2.2 ELISA篩選方法的建立 參照文獻[9]選擇6周齡雌性Balb/c小鼠進行免疫,采集血清。將Balb/c小鼠陽性血清和陰性血清均作倍比稀釋,同時設立SP2/0細胞培養(yǎng)上清及空白對照,選擇OD490nm值在1.0左右,P/N比值最大的抗原稀釋濃度為最適工作濃度。

    1.2.3 單克隆抗體及腹水的制備、篩選和鑒定 按照常規(guī)方法融合[9],用ELISA方法篩選陽性克隆,進行亞克隆及腹水制備。制備鴨胚成纖維細胞,參考文獻[9]進行單抗中和活性的測定。取細胞培養(yǎng)上清單克隆抗體,按照 Mouse MAb Isotyping Kit(Hycult Biotech)說明書進行亞類鑒定。測定單抗亞類后,用間接ELISA方法測定腹水效價。

    1.2.4 單克隆抗體的特異性 將傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、禽 呼 腸病毒 (ARV)、鵝 細 小病毒(GPV)、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨瘟病毒(DPV)、NDV LaSota株、F48E9株尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原按1∶10稀釋后包被ELISA反應板,應用ELISA方法進行測定。

    1.2.5 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立及其特異性、敏感性和重復性試驗 用PEG沉淀法[10]對2C1腹水進行純化;用辛酸-硫酸銨沉淀法[11]對兔抗鴨新城疫病毒血清進行純化,測定蛋白含量,用SDS-PAGE鑒定純度。分別以純化的單抗和多抗為包被抗體,進行雙抗體夾心ELISA,以確定最佳包被抗體。以方陣法確定抗體、抗原最佳工作濃度、作用時間等。特異性試驗是以DPMV尿囊液作為陽性對照,正常雞胚、鴨胚尿囊液為陰性對照,對IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 的尿囊液及 H5、H9標準陽性抗原進行ELISA檢測。敏感性試驗是將DPMV尿囊液作1∶5~1∶5 120稀釋,分別測定其血凝活性及ELISA效價,以確定該方法的敏感性。重復性試驗是將DPMV陰、陽性尿囊液分別按1∶10、1∶20稀釋,各做3個重復,統(tǒng)計數據計算批內變異系數;在不同時間重復3次該試驗,統(tǒng)計數據計算批間變異系數。

    1.2.6 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標準的確定 以雙抗體夾心ELISA方法檢測30份NDV非免疫雞的泄殖腔拭子樣品,根據統(tǒng)計學原則,樣本的OD490nm值>陰性樣本OD均值(ˉX)+3×SD時,可以在99.9%的水平上判定為陽性。

    1.2.7 人工感染樣品的檢測 取DPMV尿囊液1∶10稀釋后人工滴鼻感染3只6周齡SPF雞,每只0.2mL。分別于感染后1d~7d,采集對照組和感染雞的泄殖腔拭子于2mL PBS中,擠壓拭子后,5 000r/min離心5min,取0.1mL上清用ELISA方法檢測,同時平行取0.3mL上清用雙抗處理后,接種SPF雞胚制備的成纖維細胞單層進行病毒分離,每份樣品接3孔細胞,每孔0.1mL。病毒鑒定采用血凝和血凝抑制試驗。

    2 結果

    2.1 抗原的制備

    感染鴨胚尿囊液經高速離心沉淀,蔗糖密度梯度純化,取出40%~60%之間的白色病毒層,脫糖后,將沉淀溶于3mL PBS中,紫外分光光度計測得病毒的蛋白含量為6.52mg/mL。

    2.2 單克隆抗體的篩選及其特性測定

    當包被的病毒量為0.8μg/孔,陽性鼠血清1∶800稀釋,羊抗鼠二抗1∶10 000倍稀釋時,P/N比值最大,且陽性值最接近1.0。因此,選擇該條件下的抗原包被量和二抗作用濃度來篩選單克隆抗體。細胞融合后,經ELISA篩選,選取P/N>3.0的細胞孔,用有限稀釋法克隆3次后,獲得一株穩(wěn)定的雜交瘤細胞株,命名為2C1。特異性試驗表明,2C1不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原發(fā)生交叉反應,但與新城疫病毒La Sota株、F48E9株尿囊液發(fā)生反應;中和試驗結果表明,該株單抗沒有中和活性;抗體亞類鑒定表明,該單克隆抗體重鏈為IgM,輕鏈為κ鏈(圖1)。雜交瘤細胞株2C1所制備的腹水ELISA效價大于1∶64 000。

    圖1 單克隆抗體2C1亞類鑒定結果Fig.1 Subtype identification of monoclonal antibody 2C1

    2.3 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

    2C1腹水用120g/L的PEG6000溶液沉淀兩次。兔抗NDV血清經辛酸-硫酸銨沉淀法純化、透析、離心后,與純化前的腹水和多克隆抗體進行SDS-PAGE后發(fā)現,純化后的抗體在凝膠中均呈現出重鏈和輕鏈兩條特異性的條帶,且大小與預期相符(圖2)。ELISA試驗表明,以純化后的2C1腹水作為包被抗體,兔抗DPMV多克隆抗體為第二抗體,其P/N值高,且陰陽性區(qū)別明顯。方陣試驗結果表明,當純化后的單抗包被量為4μg/孔,鴨副黏病毒尿囊液1∶10稀釋,兔抗鴨副黏病毒多克隆抗體濃度為0.1μg/孔,HRP標記的羊抗兔二抗1∶10 000倍稀釋,每種組分作用1h時,P/N值最大,條件最優(yōu)。

    圖2 單抗2C1及抗NDV兔血清純化前后SDS-PAGE電泳比較結果Fig.2 The comparison of SDS-PAGE results of the unpurified and precipitated monoclonal antibody 2C1and polyclonal antibody against duck NDV

    2.4 雙抗體夾心ELISA方法特異性、敏感性和重復性的確定

    在最佳工作條件下,IBV、ARV、GPV、DHV、DPV的尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原的OD490nm值最高為0.122,與陰性對照的比值小于2,特異性良好(表1)。倍比稀釋后的尿囊液HA效價為1∶10,ELISA效價(按P/N>3.0計算)為1∶640,因此判定ELISA方法敏感性至少比HA高64倍(表2)。純化的鴨副黏病毒稀釋后,ELISA至少可以檢測到0.2μg的病毒(表3)。重復性試驗表明,兩個稀釋度抗原的批間重復變異系數為5.22%~9.15%,批內重復的變異系數為2.03%~5.34%。

    2.5 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標準的確定

    30份未免疫新城疫疫苗的雞泄殖腔拭子ELISA檢測平均OD值為0.130,標準差為0.038,計算可得,當樣品的OD490nm值大于0.244時,可判定為陽性。

    2.6 人工感染樣品的檢測結果

    根據ELISA陰陽性判定標準判定,1號雞第4天和第5天拭子檢測結果為陽性;2號雞無陽性結果;3號雞攻毒后第3、第4、第5天檢測結果陽性。這些ELISA陽性檢測結果中,1號和2號的檢測結果與病毒分離相符合,而第3號雞攻毒后的第3天和第6天檢測結果與病毒分離不符。綜合計算,ELISA檢測結果與病毒分離的總符合率為91.7%(表4)。

    表1 雙抗體夾心ELISA特異性檢測結果Table 1 The specificity of the sandwich ELISA

    表2 HA和雙抗體夾心ELISA檢測鴨新城疫病毒結果比較Table 2 The results of HA test and the sandwich ELISA for detecting the duck NDV

    表3 雙抗體夾心ELISA方法敏感性試驗Table 3 The sensitivity of the sandwich ELISA

    表4 人工感染樣品ELISA檢測結果Table 4 The detective results of experimentally infected chickens by sandwich ELISA

    3 討論

    本研究采用蔗糖密度梯度離心法純化了鴨新城疫病毒,利用淋巴細胞雜交瘤技術,獲得了一株抗鴨新城疫病毒單克隆抗體2C1的雜交瘤細胞株。單抗篩選采用了全病毒包被的間接ELISA方法,擴大了篩選范圍。2C1經中和試驗后,發(fā)現其不具有中和活性,因此在后續(xù)制備具有中和活性的單抗時用HI試驗篩選可能會獲得理想的結果。經ELISA檢測,2C1腹水的ELISA效價大于1:64 000,且與其他禽類病毒無交叉反應,證明其特異性良好,可以用于后續(xù)夾心ELISA方法的建立。單克隆抗體亞類鑒定結果表明2C1的重鏈為IgM。由于IgM通常以五聚體的形式存在,且容易聚集,在高鹽和低鹽溶液中溶解度都不高,因此純化方法有別于IgG。Mahassni S H等[13]研究發(fā)現,細胞培養(yǎng)上清中抗牛凝血素的小鼠IgM單抗最佳的純化方法是離子交換層析,而腹水中的最佳純化方法是G-100凝膠過濾。曹軍平等[10]研究發(fā)現利用PEG6000沉淀法純化的單抗較純凈,且活性損失少。綜合成本和時間因素,本研究選用PEG沉淀法進行2C1腹水的純化。而鴨新城疫病毒多克隆抗體的純化,本研究參考 McKinney M M 等[11]和曹軍平等[10]的研究,選擇了辛酸-硫酸銨法進行了純化。對純化前后的樣品進行SDS-PAGE(圖2),結果顯示純化效果良好,去除了雜蛋白,且重鏈和輕鏈分子量大小符合預期。

    在選擇夾心ELISA中的包被抗體時,用純化后的腹水2C1和純化的鴨新城疫病毒多克隆抗體分別包被酶標板,進行ELISA預試驗。結果表明,當2C1作為包被抗體,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作為第二抗體時,才能獲得較高的P/N值。方陣試驗表明,當2C1包被濃度為4μg/孔,鴨新城疫病毒尿囊液1∶10稀釋,抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作用濃度為0.1μg/孔,HRP標記的羊抗兔酶標抗體1∶10 000倍稀釋,每種成分作用1h時,P/N比值最高。特異性試驗表明所建立的鴨新城疫病毒檢測方法不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 發(fā)生交叉反應。該ELISA方法比傳統(tǒng)HA試驗方法至少敏感64倍,可以檢測出0.2μg的純化病毒。吳紅專等[6]研 制 的 PEG-ELISA 試 劑 盒 的 敏 感 性 為0.25ng~0.5ng的純化病毒,比本研究的結果高出800倍,這可能與單抗親和力及PEG具有沉淀免疫復合物的作用有關。因此,高親和力的單抗是試劑盒研制成功的關鍵。

    小樣本人工感染樣本檢測結果表明,本研究所建立的夾心ELISA方法與病毒分離的符合率為91.7%。由于所取樣本有限,后續(xù)試驗需擴大樣本檢測數量,以便評價本研究建立方法的實用性。ELISA和病毒分離的結果表明,感染后的SPF雞排毒高峰在3d~5d,這與文獻報導類似[14]。由于雙抗體夾心ELISA試驗中參與反應的成分多,非特異性反應很難完全消除。本研究在檢測含大量糞便的拭子時,ELISA檢測結果存在偏高的現象,其原因尚待進一步研究。目前,能夠進行鑒別診斷的單抗夾心ELISA方法尚不多見[6,15],且 ELISA 呈陽性者不全是強毒力株,還有中等毒毒力株或弱毒力株[16]。因此,鑒別診斷ELISA方法是今后研究的重點。

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