張 穎,魯 承,趙文婧,陳海迪,高 旭
(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,吉林延吉133000)
鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)引起的主要侵害4日齡~20日齡雛鵝的一種病毒性傳染病,該病病程短,傳染性強(qiáng),病死率高,給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重的危害[1-3]。該病毒由我國學(xué)者方定一于1956年在江蘇揚(yáng)州首次發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)VP3基因是GPV核衣殼的主要成分,約占總蛋白含量的80%,具有較高的保守性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是GPV的主要保護(hù)性抗原[4-5]。本研究擬以本課題組前期分離的延邊株(YBLJ)鵝細(xì)小病毒為毒株,克隆VP3基因和構(gòu)建真核表達(dá)載體,并研究GPV的VP3基因在Vero細(xì)胞中表達(dá)情況,為進(jìn)一步研制GPV的VP3基因核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 病毒、菌種 GPV(YBLJ株)為本實(shí)驗(yàn)室從延邊某養(yǎng)鵝場發(fā)生鵝細(xì)小病毒病的病死鵝脾臟中分離得到。大腸埃希菌JM109、pcDNA3.1(+)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ,以及ExTaq酶、DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;小鼠抗GPV VP3蛋白單抗為本試驗(yàn)室制備;FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗為Abcam公司產(chǎn)品。
1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已克隆的鵝細(xì)小病毒 YBLJ株 VP3基因序列 (GenBank:JN836326)[6],利用Loligo 6.0軟件設(shè)計(jì)合成了一對引物,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,擴(kuò)增片段長度為1 605bp。序列如下:上游5′-ATAAGCTTGCCACCATGGCAGAGGGAGGAG-3′(HindⅢ);下 游5′-CGGGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTT-3′(XhoⅠ)。
1.2.2 PCR擴(kuò)增及克隆 以提取的GPV基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min;94℃40s,58℃45s,72℃1min 40s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃10min。純化回收VP3基因片段,與克隆載體pMD-18T連接,轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞。將PCR及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。
1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的pcDNA-VP3的構(gòu)建及鑒定 將鑒定正確的克隆質(zhì)粒pMD-VP3和pcDNA質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后,回收VP3片段和pcDNA載體進(jìn)行連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP3。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行鑒定。
1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 用雙無培養(yǎng)液對重組質(zhì)粒pcDNA-VP3和LipofectamineTM 2000進(jìn)行稀釋后,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,具體方法參照說明書進(jìn)行操作。
1.2.5 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA[7-8],按照寶生物工程(大連)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測 收集轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞,在載玻片上包被后進(jìn)行冷丙酮固定,以小鼠抗GPV的VP3蛋白單抗為一抗,熒光素標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗,進(jìn)行IFA檢測,在熒光顯微鏡下觀察。
以提取的GPV基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在約1 605bp處出現(xiàn)了與預(yù)期片段大小相符的特異性目的條帶(圖1)。對PCR鑒定為陽性的真核質(zhì)粒pcDNA-VP3進(jìn)行酶切鑒定得到約5 428bp和1 605bp的2個(gè)片段(圖2),表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。同時(shí)測序結(jié)果也驗(yàn)證了真核表達(dá)載體已成功構(gòu)建。
圖1 VP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of VP3gene
圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmids by enzyme digestion
提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,在約1 605bp處有一個(gè)明顯的目的條帶(圖3)。
在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光,未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Vero細(xì)胞未出現(xiàn)綠色熒光(圖4),表明VP3基因在Vero細(xì)胞中獲得表達(dá)。
圖3 RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 Result of RT-PCR amplification
圖4 表達(dá)產(chǎn)物的IFA檢測結(jié)果 (200×)Fig.4 IFA detection result of gene expression in Vero cells(200×)
細(xì)小病毒(Parvovirus)分為自主復(fù)制型細(xì)小病毒和依賴型細(xì)小病毒,鵝細(xì)小病毒(GPV)屬于自主復(fù)制型細(xì)小病毒,復(fù)制過程不需要輔助性病毒存在,病毒為無囊膜單鏈DNA病毒。GPV主要侵害4日齡~20日齡雛鵝,病毒可垂直傳播,種鵝是主要的傳染源,通過種蛋使雛鵝感染,由于雛鵝免疫系統(tǒng)不健全,導(dǎo)致感染雛鵝大批死亡,有的死亡率高達(dá)100%,因此鵝細(xì)小病毒病又名小鵝瘟,嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展[9-11]。目前,國內(nèi)外GPV疫苗以傳統(tǒng)疫苗為主,但其存在著滅活不徹底、毒力返強(qiáng)和散毒等缺點(diǎn),致使GPV在鵝群中長期存在,無法凈化,而核酸疫苗避免了以上諸多缺點(diǎn)。因此,研制GPV核酸疫苗仍是當(dāng)務(wù)之急。
在GPV的3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2和VP3)中,衣殼蛋白VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白和病毒核衣殼的主要成分,暴露于病毒粒子表面,是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的重要抗原蛋白,所以VP3基因是研制 GPV 核 酸疫苗的首選基 因[1,5,12]。目前常用的真核表達(dá)載體有pVAX1、pcDNA3.1和pJW4304等,均含有CMV啟動(dòng)子,能夠高水平的表達(dá)外源基因,其中pcDNA3.1質(zhì)粒較小,易被細(xì)胞攝取,有助于維持mRNA的穩(wěn)定性,利于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)重組蛋白。張建遠(yuǎn)等[13]應(yīng)用pcDNA載體構(gòu)建的SARS冠狀病毒核酸疫苗和豬圓環(huán)病毒核酸疫苗免疫動(dòng)物后,結(jié)果顯示所構(gòu)建的核酸疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)。因此,本試驗(yàn)采用pcDNA作為真核表達(dá)載體,構(gòu)建了pcDNA-VP3真核表達(dá)載體。在轉(zhuǎn)染方面采用操作簡單易行、可靠的脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染,通過LipofectamineTM 2000將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP3轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中,結(jié)果表明在外源啟動(dòng)子的起始下,重組質(zhì)粒能夠在Vero細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)VP3基因,經(jīng)IFA檢測證明表達(dá)的VP3蛋白具有反應(yīng)活性,提示已成功構(gòu)建了GPV VP3基因的真核表達(dá)載體。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究GPV VP3基因在雛鵝體內(nèi)的表達(dá)情況提供了理論依據(jù),為研制GPV核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。
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