豬鏈球菌2型安徽分離株毒力基因cps2J、mrp、epf、sly的檢測及其序列分析

許大文，魏建忠，孫 裴，殷宗俊，趙洪武，李 郁

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥230036）

豬鏈球菌病是鏈球菌屬中豬鏈球菌（Streptococcus suis）、馬鏈球菌獸疫亞種、馬鏈球菌類馬亞種以及Lancefield分群中D、E、L群鏈球菌引致豬的傳染病的總稱，臨床上主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及敗血癥等癥狀［1］。我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫病。豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引致豬鏈球菌病最主要的病原。根據(jù)莢膜多糖可將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型，即1型～34型和1／2型。其中1型、2型、7型和9型對(duì)豬的致病性較強(qiáng)，豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2）在世界范圍內(nèi)流行最廣，屬于人獸共患傳染病病原［2］。

S.suis 2的致病性與其攜帶的毒力因子密切相關(guān)，目前公認(rèn)的主要毒力因子有莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein factor，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）等［3］。S.suis 2毒力基因表型的分布具有地域性的差異，某些地區(qū)以mrp或epf基因?yàn)橹鳎硪恍┑貐^(qū)則以sly基因?yàn)橹鳎?］。本研究針對(duì)cps2J、mrp、epf和sly 4種毒力基因，對(duì)19株S.suis 2安徽分離株進(jìn)行PCR檢測及其擴(kuò)增片段序列測定與比較，旨在了解S.suis 2安徽分離株毒力基因的分布特征，以及與國內(nèi)外分離株之間的遺傳關(guān)系，從而為S.suis 2安徽分離株的致病性研究奠定基礎(chǔ)，為安徽省豬鏈球菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株 19株S.suis 2安徽分離株均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病研究室于2008年-2012年分離、鑒定及保存。菌株代號(hào)以分離地區(qū)和先后命名。

1.1.2 主要試劑 胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）均為紹興天恒生物科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、r Taq DNA聚合酶、DNA膠回收試劑盒均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)［5-8］分別針對(duì)cps2J、mrp、epf、sly合成引物，引物均由上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 本試驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this experiment

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備與毒力基因的擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［9］提取細(xì)菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL：10×buffer MIX（MgCl2contained）2.5μL，dNTPs（2.5mmol／L）2μL，TaqDNA聚合酶（2.5U／μL）0.3μL，上游引物1μL，下游引物1μL，滅菌ddH2O 13.2μL，模板5μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，退火1min（cps2J、mrp、epf、sly檢測的退火溫度分別為56、55、60、58℃），72℃2min，循環(huán)40次；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與測序 PCR產(chǎn)物的回收與純化按照DNA膠回收試劑盒的說明進(jìn)行，將純化的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 基因序列分析 將cps2J、mrp、epf和sly基因測序結(jié)果與GenBank登錄的國內(nèi)外豬鏈球菌參考菌株的同源基因序列進(jìn)行比對(duì)（表2），并用DNA Star軟件進(jìn)行基因變異分析。

表2 GenBank登錄的國內(nèi)外豬鏈球菌參考菌株Table 2 Domestic and international reference strains of Streptococcus suis accessioned in GenBank

2 結(jié)果

2.1 毒力基因鑒定

cps2J、mrp、epf和sly基因在19株S.suis2安徽分離株中的檢出率分別為100%（19／19）、68.4%（13／19）、68.4%（13／19）、78.9%（15／19）。19個(gè)受試菌株共分為7個(gè)基因型：cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋（11／19），cps2J＋／mrp＋／epf-／sly＋ （1／19），cps2J＋／mrp＋／epf-／sly-（1／19），cps2J＋／mrp-／epf＋／sly＋（1／19），cps2J＋／mrp-／epf＋／sly-（1／19），cps2J＋／mrp-／epf-／sly＋ （2／19），cps2J＋／mrp-／epf-／sly-（2／19）；其中cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋為優(yōu)勢基因型（表3）。

表3 19株S.suis 2安徽分離株毒力基因檢測結(jié)果Table 3 The test results of virulent genes of S.suis 2strains isolated from Anhui province

2.2 毒力基因序列分析

將19株S.suis2安徽分離株的cps2J及其中13個(gè)菌株的mrp基因、13個(gè)菌株的epf基因和15個(gè)菌株的sly基因部分序列與GenBank登錄的同源基因進(jìn)行同源性、基因變異分析。

2.2.1 同源性分析 19株S.suis2安徽分離株之間cps2J基因部分序列之間及其與國內(nèi)、國外S.suis2參考菌株的同源性分別為99.7%～100%、99.4%～100%和98.3%～100%；13個(gè)S.suis2安徽分離株之間mrp基因部分序列之間及其與國內(nèi)、國外S.suis2參考菌株的同源性的分別為99.1%～100%、99.1%～100%和99.2%～100%；13個(gè)S.suis2安徽分離株之間epf基因部分序列之間及其與國內(nèi)、國外S.suis2參考菌株的同源性分別為100%、99.8%～100%和87.8%～100%；15個(gè)S.suis2安徽分離株之間sly基因部分序列之間及其與國內(nèi)、國外S.suis2參考菌株的同源性分別為100%、100%和99.0%～100%。

2.2.2 基因變異分析S.suis2安徽分離株中僅菌株FD12在cps2J基因的比對(duì)序列中第548～549位存在GA插入突變，第550位由A突變?yōu)镚（圖1）。菌株HJ6和HJ3的mrp基因序列完全一致，在比對(duì)序列的第37～41位存在TGAAG 2個(gè)堿基插入突變，第47位A缺失，第64～65位有TA插入突變，第91位由G突變?yōu)镃，第94～95位由GC突變?yōu)門T，第97位有T插入突變，第347位由G突變?yōu)門，第808位存在A插入突變，第814位由T突變?yōu)镚；菌株FD12在比對(duì)序列的第1位由C突變?yōu)锳，第349～356存在AATTGCTC的缺失突變；菌株HJ14在比對(duì)序列的第24位由G突變?yōu)镃；菌株HJ15、HJ17在比對(duì)序列的第820位存在A插入突變（圖2）。epf基因和sly基因的檢測序列未檢測出變異。

圖1 cps2J基因部分序列的變異位點(diǎn)Fig.1 Variation site of cps2Jgene nucleotide sequence

圖2 mrp基因部分序列的變異位點(diǎn)Fig.2 Variation site of mrpgene nucleotide sequence

3 討 論

根據(jù)毒力不同，S.suis2分為強(qiáng)毒株、弱毒株和無毒株，其致病機(jī)理目前還不很清楚，但普遍認(rèn)為其致病性與其毒力因子有關(guān)［10］。S.suis2的4種毒力因子（CPS、MRP、EPF和SLY）在不同毒力菌株中的分布有較大差異，臨床分離株常存在一種乃至全部毒力基因的缺失現(xiàn)象，而典型的強(qiáng)毒株常帶有這4種 毒 力 基 因［8，11-12］。1999 年，Staats J J 等［13］報(bào)道，5株S.suis2強(qiáng)毒株的毒力基因型均為cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋。Wei Z等［14］報(bào)道，我國16個(gè)省份在2003年-2007年分離176株S.suis2，有54%的毒力基因型為cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋。張九州等［12］報(bào)道，2007年-2008年從河南省分離的8株S.suis2，有4株毒力基因型為cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋。王花茹等［15］檢測四川資陽豬2型鏈球菌病的12株臨床分離株的毒力基因，結(jié)果均為cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋。趙戰(zhàn)勤等［16］將毒力基因型為cps2J／mrp＋／ef＋／sly＋的16株S.suis2進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn)，結(jié)果均能致死全部小鼠。本試驗(yàn)針對(duì)這4種毒力基因進(jìn)行了19株S.suis2安徽分離株的檢測，結(jié)果顯示，57.9%（11／19）菌株的毒力基因型為cps2J＋／mrp＋／epf＋／sly＋，為優(yōu)勢基因型，表明安徽省豬群中流行的S.suis2毒力基因的分布特征與國內(nèi)外報(bào)道的相似，CPS、MRP、EPF和SLY是安徽省流行的S.suis2的重要毒力因子。

序列同源性分析顯示，S.suis2安徽分離株4種毒力基因的檢測序列之間及其與國內(nèi)其他地區(qū)S.suis2分離株的相應(yīng)序列同源性很高（均在99.1%以上），與國外S.suis2分離株的相應(yīng)序列同源性相對(duì)較低（87.8%～100%）?；蛐蛄凶儺惙治霰砻鱏.suis2安徽分離株的mrp基因存在相對(duì)較大的變異，13株mrp＋菌株中有6株發(fā)生了序列變異，其中HJ3和HJ6序列的變異最大。參考菌株中僅浙江GQ352520在比對(duì)序列的第657位存在由T突變?yōu)镃的點(diǎn)突變，其他序列完全一致。表明S.suis 2安徽分離株的mrp基因具有不同程度的分化，與國內(nèi)外其他地區(qū)S.suis 2分離株序列存在較大差異。S.suis 2的MRP存在多種突變體，MRP＊表示分子質(zhì)量大于136ku的MRP突變體，MRPS用來表示分子質(zhì)量小于136ku的MRP突變體［8］。S.suis 2安徽分離株中可能存在 MRP＊或MRPS，但由于檢測序列不是基因全序列，這些堿基突變是否是有義突變，是否存在移碼突變，及其對(duì)S.suis 2的致病性的影響還有待進(jìn)一步研究。

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