附子正丁醇、水提取物對(duì)虛寒證模型大鼠ATP酶活性及能荷的影響＊

劉 珊，滕佳林，韓冰冰，劉一洋，楊富梅

（山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為虛寒證多由素體陽(yáng)虛，或久居寒涼之處或氣虛進(jìn)一步發(fā)展，或過服寒涼之品，或房事太過，傷腎陽(yáng)等，以致臟腑機(jī)能減退，機(jī)體失去陽(yáng)氣的溫煦，寒從內(nèi)生，于是形成病性屬虛、屬寒的證候。依據(jù)中醫(yī)的治療原則“熱者寒之，寒者熱之”，應(yīng)選用溫?zé)崴庍M(jìn)行治療，而附子是“回陽(yáng)救逆第一品”，通過觀察附子對(duì)虛寒模型大鼠三磷酸腺苷（adenosine triphoshate，ATP）酶活性及能荷代謝指標(biāo)的影響，分析其作用趨勢(shì)、特點(diǎn)及規(guī)律，揭示其與寒熱藥物屬性的內(nèi)在聯(lián)系，為更好地指導(dǎo)臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí) Wistar大鼠，40只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，由魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［許可證編號(hào):SCXK（魯）20080002］。動(dòng)物室環(huán)境為SPF級(jí)，按晝夜節(jié)律自然照明，于獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠飼養(yǎng)，室溫22～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，予60Co輻照飼料和純凈水飼喂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.1.2.1 中藥材 生石膏、龍膽草、黃柏和知母，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李峰教授鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2.2 造模藥的制備 造模復(fù)方生石膏、龍膽草、黃柏和知母按比例（2.0∶1.2∶1.0∶1.5）混合后加蒸餾水煎煮2次，分別過濾，合并2次濾液，65℃水浴濃縮至含生藥量生藥3.2g／mL，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2.3 治療藥 附子正丁醇提取物0.3980g、附子水提物34.3558g（山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供），均相當(dāng)于附子生藥量28.35g，分別溶于水和吐溫80的混合液制成混懸液，制成每毫升含有附子正丁醇0.0019g的溶液，附子水提物0.1636g，均相當(dāng)于每毫升溶液含有0.135g生藥。

1.1.3 試劑 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品（adenosine 5′－triphosphate disodium salt，Grade 1，minium 99%）為 Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào):028K7009；ADP 標(biāo) 準(zhǔn) 品 （adenonisine 5′－disphosphate sodium salt，from bacterial source）為 Sigma 公 司 產(chǎn) 品，批 號(hào):107K7030；AMP 標(biāo)準(zhǔn)品（adenosine 5′－monophosphate sodium salt，minium 99%）為Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào):107K7003。乙腈（批號(hào):20090522），娃哈哈純凈水（批號(hào):201009252113WF），生理鹽水（批號(hào):100907E05），四汀基溴化銨（批號(hào):2009年3月15日），磷酸二氫鈉（批號(hào):2009年5月15日），磷酸三鈉（批號(hào):2009年9月18日），磷酸（批號(hào):20100331）。ATP酶測(cè)試驗(yàn)盒（批號(hào):20100824）為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.4 主要儀器 獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠（型號(hào):I5，蘇州市蘇杭科技器材有限公司），電子天平（型號(hào):JA5003，上海精科天平廠），電子天平（型號(hào):WT11001R，江蘇省常州市萬得天平儀器廠），恒溫水浴鍋（型號(hào):HH系列，江蘇金壇中大儀器廠），紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào):WFZ800－D3B），全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)（型號(hào):GL－20A，湖南離心機(jī)廠），高效液相色譜儀（二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、FLD檢測(cè)器，型號(hào):Agilent1100，安捷倫公司），電子體溫計(jì)（型號(hào):歐姆龍 MC－142L型，歐姆龍大連有限公司），四通道自主活動(dòng)測(cè)定儀（型號(hào):H－ZYC－1）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為:空白對(duì)照組（10只），模型組（10只），附子正丁醇組（10只），附子水提物組（10只）。

1.2.2 模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后開始造模，除空白對(duì)照組均給灌含生藥量3.2g／mL的造模藥5mL，每天1次，連續(xù)14d，空白對(duì)照組每天灌服等量的生理鹽水。空白對(duì)照組和附子提取物組在造模過程中各意外死亡1只，故這兩組分別為9只。

1.2.3 外觀觀察及體質(zhì)量、肛溫自主活動(dòng)的測(cè)定 造模過程中觀察并記錄各組大鼠的毛發(fā)色澤、行為狀態(tài)、飲食、大便等外觀方面的變化。18:00開始測(cè)量肛溫，使用歐姆龍電子體溫計(jì)檢測(cè)大鼠肛溫，將涂有凡士林的測(cè)溫探頭插入直腸約3cm，測(cè)溫計(jì)顯示數(shù)字穩(wěn)定蜂鳴音提示后讀取數(shù)字。自主活動(dòng)使用HZYC－1型四通道自主活動(dòng)測(cè)定儀記錄各組大鼠5min自主活動(dòng)次數(shù)，各組動(dòng)物平行交替進(jìn)行測(cè)試。

1.2.4 治療 按大鼠體質(zhì)量給附子正丁醇、附子水提取物組大鼠灌服附子正丁醇、水提取物（每毫升含有0.135g生藥），給藥劑量每千克為1.35g生藥，每天1次，連續(xù)7d。

1.2.5 肝組織勻漿液的制備 取出肝臟，用生理鹽水洗凈，稱取0.5g左右置于勻漿器中，按1∶9的比例將蒸餾水和0.9%的生理鹽水混勻用來研麿肝組織，之后將組織勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，置冷凍離心機(jī)，4℃以3000r／min離心15min。

1.2.6 檢測(cè)方法

1.2.6.1 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶檢測(cè)方法取肝組織勻漿液上清，檢測(cè)方法按ATP酶試劑盒說明操作。

1.2.6.2 ATP及能荷檢測(cè)方法 取肝組織勻漿液0.5mL加入預(yù)冷的2.4mmol／L的高氯酸（ClO4）100μL，3500r／min，離心10min，取上清液加入與上清液等體積的1mol／L的磷酸氫二鉀（K2HPO4），調(diào)pH 至 6.5～7.0，再次3500r／min，離心10min，取上清液用0.45μm濾過膜濾過即成色譜分析樣品，以上操作在4℃下完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外觀指標(biāo) 模型組大鼠，造模當(dāng)日或第2天開始出現(xiàn)軟便，繼而出現(xiàn)便溏、肛門周圍有污物、泄瀉、食欲減少、活動(dòng)減少、畏寒蜷縮、閉目無神；造模第5天出現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)逐日下降、懶動(dòng)、肛溫溫度略降、喜聚堆、皮毛疏松無光澤?？瞻讓?duì)照組大鼠飲食、大便正常，毛發(fā)有色澤，行為狀態(tài)正常。

2.2 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠體質(zhì)量、肛溫及自主活動(dòng)的影響 由表1可見，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)都有下降的趨勢(shì)，且模型組的肛溫較空白對(duì)照組下降明顯（P＜0.01）。

表1 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)的影響（）

表1 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)的影響（）

△:P＜0.01，與空白對(duì)照組比較。

組別 n 體質(zhì)量（g） 肛溫（℃） 自主活動(dòng)（次）空白對(duì)照組9256.93±21.5936.84±0.55200.22±134.18模型對(duì)照組 10239.36±21.8035.98±0.70△139.60±83.16附子正丁醇 10249.19±27.1036.24±0.70155.60±90.27附子水提物9251.87±18.3936.15±0.38162.56±63.53

2.3 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶含量的影響 由見表2可見，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠 Na＋－K＋－ATP酶活性明顯降低（P＜0.01）；附子水提物組比附子正丁醇組有增強(qiáng)的趨勢(shì)，差異不明顯。與空白對(duì)照組相比，模型組Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性明顯減弱（P＜0.01）；與模型組相比，附子正丁醇組Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性增強(qiáng)（P＜0.05）；附子正丁醇組比附子水提物組 Ca2＋－Mg2＋－ATP活性增強(qiáng)（P＜0.05）。

表2 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠Na＋K＋－ATP酶、Ca2＋Mg2＋－ATP酶含量的測(cè)定（）

表2 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠Na＋K＋－ATP酶、Ca2＋Mg2＋－ATP酶含量的測(cè)定（）

△:P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；＊:P＜0.05，與模型組比較；▲:P＜0.05，與附子正丁醇組比較。

組別 n Na＋－K＋－ATP酶（μmolpi·mgprot－1·h－1）Ca2＋－Mg2＋－ATP酶（μmolpi·mgprot－1·h－1）空白對(duì)照組9 0.9178±0.2470 1.2072±0.3918模型對(duì)照組 10 0.4050±0.2225△ 0.4628±0.1682△附子正丁醇 10 0.5043±0.1037 0.8857±0.4413＊附子水提物 9 0.6483±0.2209 0.4900±0.4185▲

2.4 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠ATP含量及能荷的影響 由表3可見，與空白對(duì)照組相比，模型組ATP含量及能荷均降低（P＜0.05）；與模型組相比，附子正丁醇組能荷比例升高（P＜0.05），其他治療組均有上升的趨勢(shì)；這兩項(xiàng)指標(biāo)中，附子水提物組比附子正丁醇組有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

表3 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠ATP含量及能荷的測(cè)定（）

表3 附子提取物對(duì)虛寒證模型大鼠ATP含量及能荷的測(cè)定（）

▲:P＜0.05，與空白對(duì)照組相比較；＊:P＜0.05，與模型對(duì)照組相比較。

組別 n ATP（μg／g） 能荷空白對(duì)照組9 0.2173±0.08620.8642±0.0635模型對(duì)照組 10 0.0528±0.0661▲ 0.6553±0.1514▲附子正丁醇 100.0572±0.0323 0.7084±0.1017＊附子水提物9 0.0936±0.09450.8049±0.0779

3 討 論

虛寒證是陽(yáng)氣不足引起的寒證，虛寒證動(dòng)物模型是中醫(yī)證候動(dòng)物模型中研究較多的一種，以北京醫(yī)科大學(xué)研制者較為典型［1］。由于是間接地以寒涼因素致虛，所以在寒證病理存在的同時(shí)，虛證本身是否存在這一問題還需要解決。本實(shí)驗(yàn)采用的造模方藥（包括比例）是北京醫(yī)科大學(xué)較為成熟的虛寒證造模方藥，無直接瀉下藥味，而動(dòng)物出現(xiàn)明顯腹瀉，說明是因寒涼過度所致，也說明本造模量損傷機(jī)體元?dú)廨^甚。外觀指標(biāo)以逐漸出現(xiàn)毛臟、毛枯，精神萎靡，蜷縮，倦怠乏力，便溏腹瀉，受激排便增多，舌偏淡嫩、淡白，苔少為特征，體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩，肛溫較低，食量減少，飲水量較實(shí)驗(yàn)前減少，以上表現(xiàn)基本符合虛寒證表現(xiàn)。從體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)來看，模型組各指標(biāo)數(shù)值均小于空白對(duì)照組，特別是模型組的體溫較空白組明顯下降（P＜0.01），而經(jīng)過治療后各項(xiàng)指標(biāo)又有所恢復(fù)?，F(xiàn)代藥理研究亦證實(shí)，附子能加強(qiáng)心血管循環(huán)、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)心肌收縮力、加快心率、增加心排出量和冠狀動(dòng)脈血流量等［2］，也具有抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等藥理活性，其中二萜生物堿類成分被認(rèn)為是其特征性的活性成分［3－6］，能上助心陽(yáng)，中溫脾陽(yáng)，下補(bǔ)腎陽(yáng)，用于治療虛寒證非常適合。

從虛寒證大鼠的表現(xiàn)來看，精神萎靡，蜷縮，倦怠乏力，體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩，體溫較低，食量減少，飲水量較實(shí)驗(yàn)前減少均顯示虛寒證大鼠的能量代謝降低，因ATP酶是反映機(jī)體能量代謝的可靠指標(biāo)，故對(duì)虛寒證大鼠ATP酶的研究具有重要意義。ATP酶是存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器生物膜上的一種蛋白酶，其在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞以及維持細(xì)胞膜的完整、組織代謝等方面具有重要的意義，可作為代謝紊亂及損傷組織恢復(fù)能力的可靠指標(biāo)［7］。ATP酶是逆離子梯度進(jìn)行細(xì)胞膜內(nèi)、外轉(zhuǎn)運(yùn)的離子泵，其中重要的為 Na＋－K＋－ATP酶和 Ca2＋－Mg2＋－ATP酶［10］。由于 Na＋－K＋－ATP酶主要與 ATP的分解和利用有關(guān)，維持細(xì)胞正常內(nèi)外離子濃度和膜電位，故其活性是反映機(jī)體能量代謝水平和生理功能狀態(tài)的重要指標(biāo)［11］。而在消耗ATP的同時(shí)也釋放出大量的熱能，所以Na＋－K＋－ATP酶的活性越高，體內(nèi)能量消耗和產(chǎn)熱過程也越強(qiáng)。另有實(shí)驗(yàn)研究表明，甲狀腺激素的產(chǎn)熱作用也與Na＋－K＋－ATP酶的關(guān)系十分密切。Ca2＋－Mg2＋－ATP酶是細(xì)胞膜上另一種重要的酶，是一種疏水的膜結(jié)合蛋白。此酶轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2＋和水解ATP都需要 Mg2＋存在，故稱 Ca2＋－Mg2＋－ATP 酶，其在維持細(xì) 胞內(nèi)Ca2＋和Mg2＋濃度穩(wěn)定，對(duì)心肌及其他肌肉的收縮、神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的傳導(dǎo)、細(xì)胞的分泌和繁殖均有重要影響［8］。該酶的主要作用涉及ATP的分解利用和細(xì)胞內(nèi)外Ca2＋濃度的維持，其活性受ATP含量、Ca2＋濃度等多種因素的影響。當(dāng)ATP含量下降、胞內(nèi)Ca2＋濃度增高或膜脂質(zhì)過氧化時(shí)，該酶的活性降低［9］。所以，Ca2＋－Mg2＋－ATP酶是衡量線粒體功能和能量代謝水平的一個(gè)重要的指標(biāo)。對(duì)于虛寒證大鼠來說，模型組大鼠 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性都比空白對(duì)照組弱，用藥各組均比模型組活性強(qiáng)；同時(shí)從ATP含量來看，模型組比空白對(duì)照組明顯較低，治療后又升高，能荷的趨勢(shì)也是一樣。

由此可見ATP酶活性降低可能是造成虛寒模型的原因之一。附子正丁醇和附子水提物能提高虛寒證大鼠的ATP酶活性及能荷的比例，有利于虛寒證大鼠的物質(zhì)代謝的恢復(fù)，提高ATP酶活性有利于虛寒癥的治療，具體情況仍有待進(jìn)一步研究。

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