馬來(lái)酸桂哌齊特對(duì)腦缺血后炎癥反應(yīng)、軸突蛋白的表達(dá)及神經(jīng)功能的影響

黃艷玲，張 敏，賀 曦

（重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科 400014）

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）是主要由單個(gè)核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和單核－巨噬細(xì)胞）產(chǎn)生的一組免疫活性因子，作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞，共同參與機(jī)體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)及炎癥的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，IL在腦缺血后表達(dá)明顯增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，介導(dǎo)腦缺血后炎性反應(yīng)，參與缺血性腦損傷。本研究擬觀察馬來(lái)酸桂哌齊特（cinepazide maleate，CM）對(duì)大鼠腦缺血／再灌注后腦組織炎癥反應(yīng)、神經(jīng)絲蛋白－200（NF－200）的表達(dá)及對(duì)神經(jīng)功能的影響，更深入地探討CM對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年雄性SD大鼠48只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，體質(zhì)量250～280g。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、缺血／再灌注2d組、缺血／再灌注7d組、CM治療2d組和CM治療7d組，每組8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與用法 CM由北京四環(huán)生物制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為每支80mg。于再灌注后按3.0mg／kg進(jìn)行稀釋?zhuān)⒓磸奈察o脈注射，每日1次。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動(dòng)脈閉塞 （MCAO）模型的制作 術(shù)前12h禁食。參照 Longa等［1］及 Nagasawa和 Kogure［2］的線栓法:用3.5%水合氯醛（1mL／100g，腹腔注射）麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠仰臥位固定，備皮，術(shù)區(qū)消毒，鋪無(wú)菌洞巾，頸正中切口，暴露并分離右側(cè)頸總、頸外與頸內(nèi)動(dòng)脈，電凝頸外動(dòng)脈的分支，結(jié)扎并離斷。將頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈之間的交通支凝斷，夾閉頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈殘端切口向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線（18.0±0.5）mm，感覺(jué)有阻力即達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，固定栓線，縫合傷口。缺血2h后拔出栓線，實(shí)現(xiàn)再灌注。大鼠缺血／再灌注6h后的神經(jīng)功能評(píng)分采用Longa評(píng)分法［1］:0分為無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分為輕度局灶性神經(jīng)功能缺失癥狀（不能完全伸展左側(cè)前肢）；2分為中度局灶性神經(jīng)功能缺失癥狀（向左側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分為中、重度局灶性神經(jīng)功能缺失癥狀（向左側(cè)傾倒）；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。1～3分入組，0分和4分者均被剔除。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，取材時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者也剔除，隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.2 腦組織IL－1β，IL－6含量測(cè)定 各組大鼠在腦缺血／再灌注2d，7d后斷頭取腦，于冰盤(pán)上迅速取缺血側(cè)大腦半球，用全蛋白提取試劑盒提取蛋白（南京凱基），低溫離心后留取上清液，采用ELISA測(cè)定IL－1β及IL－6，試劑購(gòu)自R＆D公司，以上2個(gè)指標(biāo)均按試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.3 腦組織NF－200免疫組織化學(xué)染色 將大鼠深度麻醉后開(kāi)胸，用生理鹽水與4%多聚甲醛各150mL進(jìn)行灌流，斷頭取腦，4%多聚甲醛液中固定4～6h，然后放入70%乙醇中送組織切片，片厚8μm。取相同層面切片分別做 HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用S－P法，DAB顯色。所用抗NF－200的一抗?jié)舛染鶠?∶100，購(gòu)自博士德公司；S－P即用型工作試劑盒由北京中杉生物公司提供，免疫組化步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。NF－200陽(yáng)性蛋白的平均光密度值用Imagepro－Plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)定，具體操作參考軟件教程。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 根據(jù)Longa等［1］評(píng)分法，術(shù)后6h缺血／再灌注組和CM治療組大鼠評(píng)分（共32只）達(dá)到3分的共7只（7／32，21.9%），2分的共19只（19／32，59.4%），1分的共6只（6／32，18.7%）。在缺血／再灌注后第7天，兩組大鼠的評(píng)分較前明顯改善（P＜0.05）；此外，CM治療組大鼠的神經(jīng)功能改善程度較缺血／再灌注組更明顯（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠缺血／再灌注后第2、7天神經(jīng)功能評(píng)分（，分）

表1 兩組大鼠缺血／再灌注后第2、7天神經(jīng)功能評(píng)分（，分）

正常組、假手術(shù)組評(píng)分為0；a:P＜0.05，與缺血／再灌注第2天比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注組比較。

組別 第2天 （n＝16） 第7天（n＝16）缺血／再灌注組 2.00±0.76 1.25±0.71a CM治療組 2.00±0.76 0.50±0.53ab

2.2 腦組織IL－1β，IL－6的含量 正常組和假手術(shù)組腦組織IL－1β、IL－6水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），缺血／再灌注后第2天，缺血／再灌注組與CM治療組腦組織IL－1β、IL－6水平均較正常組明顯升高（P＜0.01），但治療組明顯低于缺血／再灌注組（P＜0.01）。隨后IL－1β、IL－6逐漸下降，第7天時(shí)缺血／再灌注組和CM治療組IL－1β，IL－6水平較前明顯下降（P＜0.01），且CM治療組較缺血／再灌注組下降更明顯（P＜0.01），其中IL－6的水平與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 腦組織NF－200 免疫組化檢測(cè)顯示正常組和假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元軸突形態(tài)規(guī)則，NF－200陽(yáng)性纖維較長(zhǎng)，排布均勻。缺血／再灌注2d組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元NF－200陽(yáng)性纖維縮短且數(shù)量顯著減少（P＜0.01），排布紊亂；7d后陽(yáng)性軸突數(shù)目有所增加，但仍低于正常水平（P＜0.01）。與相同時(shí)間點(diǎn)缺血／再灌注組相比，CM治療組軸突形態(tài)較規(guī)則，NF－200陽(yáng)性纖維表達(dá)有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腦組織IL－1β，IL－6含量的比較（，pg／mL）

表2 各組大鼠腦組織IL－1β，IL－6含量的比較（，pg／mL）

a:P＜0.01，與正常組比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注第2天比較；c:P＜0.01，與缺血／再灌注第7天比較。

指標(biāo) 正常組 假手術(shù)組缺血／再灌注組第2天 第7天CM 治療組第2天 第7天IL－1β 426.00±35.43 430.38±36.36 873.50±68.41a616.75±37.46ab 649.50±29.95ab 489.25±43.89abc IL－6 585.38±82.52 592.25±38.17 936.88±99.57a776.88±52.77ab 808.38±67.33ab 639.50±52.52bc

表3 各組大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血側(cè)皮質(zhì)NF－200的平均光密度值（）

表3 各組大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血側(cè)皮質(zhì)NF－200的平均光密度值（）

a:P＜0.01，與正常組及假手術(shù)組比較；b:P＜0.01，與缺血／再灌注第2天比較；c:P＜0.01，與缺血／再灌注第7天比較。

組別平均光密度值第2天 第7天正常組0.333±0.064 0.333±0.064假手術(shù)組 0.315±0.117 0.317±0.118ab缺血／再灌注組 0.118±0.084a 0.207±0.037ab CM治療組 0.186±0.029ab 0.289±0.143bc

3 討 論

炎性反應(yīng)是缺血性卒中的一個(gè)重要病理過(guò)程，缺血狀態(tài)下高濃度的炎性細(xì)胞因子可能參與了神經(jīng)損傷。近期研究發(fā)現(xiàn)，IL－1等可激活局部血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞大量牢固的黏附，導(dǎo)致微血管阻塞，從而加重腦細(xì)胞的損傷［3］。IL－6也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血相關(guān)的重要炎癥反應(yīng)分子之一，IL－1 mRNA和IL－6mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬結(jié)構(gòu)和齒狀回均有定位［4］，IL－6水平在腦缺血／再灌注早期升高，認(rèn)為可能與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)大鼠缺血／再灌注第2天的腦組織勻漿進(jìn)行ELISA檢測(cè)，作者發(fā)現(xiàn)IL－1β和IL－6均較正常時(shí)明顯增加，提示IL在腦缺血早期即參與了腦損傷的病理、生理過(guò)程。之后，在第7天，IL－1β和IL－6水平均有所回落，表明了自身調(diào)節(jié)啟動(dòng)了內(nèi)源性修復(fù)。

長(zhǎng)久以來(lái)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后必然導(dǎo)致某些功能永久喪失的悲觀理念一直在生物醫(yī)學(xué)界占統(tǒng)治地位。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后喪失的功能是可以得到一定程度恢復(fù)的［5－6］。腦內(nèi)神經(jīng)元胞體只占據(jù)皮質(zhì)總體積的3%，而軸突、樹(shù)突及神經(jīng)膠質(zhì)則占了97%，當(dāng)部分神經(jīng)元死亡時(shí)，存活細(xì)胞中豐富的軸突可通過(guò)側(cè)枝出芽的方式取代損傷的軸突，代償其功能［7－8］。NF是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，在維護(hù)神經(jīng)元的功能和軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)等一系列與脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的病理、生理變化中發(fā)揮著重要作用［9］。NF依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同可分為 NF－68、NF－140及 NF－200三種。其中 NF－200在正常情況下只存在于軸索中，而胞體不含或很少含有，故正常時(shí)NF－200胞體為陰性。有研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷區(qū)附近的神經(jīng)元在創(chuàng)傷刺激及多種誘導(dǎo)因子的作用下，能大量合成及積存NF－200以適應(yīng)神經(jīng)再生的需要，此時(shí)NF－200可在神經(jīng)元胞體內(nèi)著色［10－11］。脊髓不完全損傷后 NF－200陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量及神經(jīng)元胞體著色的程度與后肢的功能恢復(fù)情況有密切的關(guān)系，說(shuō)明NF－200染色不僅能顯示傷后神經(jīng)元的形態(tài)，也能反映其功能狀態(tài)［12］。在缺血／再灌注后，NF－200在皮質(zhì)的表達(dá)明顯減少，這與神經(jīng)元缺血／再灌注損傷的發(fā)生是一致的。軸突的損傷及缺失，必然對(duì)神經(jīng)細(xì)胞間的功能聯(lián)系和傳遞有著不可避免的影響，因此大鼠的神經(jīng)功能受損后恢復(fù)存在困難。這也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

CM作為新一代的哌嗪類(lèi)鈣離子拮抗劑，除了能夠抑制鈣離子內(nèi)流、擴(kuò)張血管外，研究還發(fā)現(xiàn)它能通過(guò)抑制腺苷脫氨酶的作用延遲腺苷的降解，減少肌酐和次黃嘌呤的生成，使腺苷在組織內(nèi)蓄積。腺苷作為內(nèi)源性保護(hù)因子在腦缺血損傷中表現(xiàn)出了顯著的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及神經(jīng)調(diào)節(jié)作用［13］。本研究運(yùn)用CM對(duì)腦缺血／再灌注大鼠進(jìn)行急性期治療，從減輕腦組織炎癥反應(yīng)、促進(jìn)軸突再生及改善神經(jīng)功能3個(gè)方面，探討了CM對(duì)急性缺血性腦損傷的保護(hù)作用。CM治療組與缺血／再灌注組比較后發(fā)現(xiàn):CM 能夠顯著抑制腦內(nèi)IL－1β、IL－6的過(guò)度表達(dá)，明顯增加腦皮質(zhì)NF－200的表達(dá)，還伴隨神經(jīng)功能缺損的明顯改善。這些都提示，CM可能從以上環(huán)節(jié)對(duì)缺血性腦損傷發(fā)揮了較好的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)更加突出。

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