梨形四膜蟲細(xì)胞毒性苯酚類似物的三維定量結(jié)構(gòu)毒性相關(guān)研究＊

王遠(yuǎn)強(qiáng)，劉躍輝，丁 元，張婭，林治華

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院 400054）

苯酚類化合物作為有機(jī)工業(yè)中一類重要的物質(zhì)被廣泛地用作防腐劑、防銹劑、農(nóng)業(yè)化學(xué)品、生物殺傷劑、染料、殺真菌劑和殺蟲劑等，其廣泛存在于環(huán)境中并對(duì)環(huán)境、尤其是水環(huán)境造成嚴(yán)重污染［1－4］。目前苯酚等4種酚類化合物被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局列為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物，7種苯酚類化合物被確認(rèn)為中國(guó)優(yōu)先控制的有機(jī)污染物；因此，苯酚類化合物的毒性研究近年來(lái)成為熱點(diǎn)。定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure activity relationship，QSAR）研究在現(xiàn)代化學(xué)和生物化學(xué)研究領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用，同時(shí)在環(huán)境污染物的生物活性和生物毒性評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用［5－7］。

定量結(jié)構(gòu)毒性相關(guān)性（quantitative structure－toxicity relationships，QSTR）研究是指一組化合物的生物毒性與其結(jié)構(gòu)特征之間的相互關(guān)系，是一種基于化合物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其毒性，并能進(jìn)一步分析毒性作用機(jī)制的研究方法。近年來(lái)，QSTR研究在環(huán)境污染物、毒性研究預(yù)測(cè)方面獲得了廣泛的應(yīng)用。本文使用比較分子相似性指數(shù)分析（comparative molecular similarity indices analysis，CoMSIA）方法對(duì)系列具有梨形四膜蟲細(xì)胞毒性的苯酚類似物進(jìn)行了三維定量結(jié)構(gòu)毒性相關(guān)研究（3DQSTR），系統(tǒng)分析了立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)及協(xié)同作用對(duì)模型的影響，并建立了相應(yīng)的3D－QSTR［9－11］。

1 CoMSIA的原理及研究方法

1.1 CoMSIA簡(jiǎn)介 自CramerⅢ在1988年創(chuàng)建比較分子力場(chǎng)分析（CoMFA）方法以來(lái)，CoMFA已經(jīng)發(fā)展成為三維定量構(gòu)效關(guān)系（3D－QSAR）研究中使用最廣泛且最有效的工具之一［12］，它主要用于研究分子周圍的非鍵分子場(chǎng)（立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)）改變時(shí)，其相應(yīng)的活性所發(fā)生的變化［13－16］。1994年，Klebe等［16］提出CoMSIA方法，該方法是CoMFA的一種擴(kuò)展，兩者的原理基本相同，都基于如下假設(shè):分子的親和力改變時(shí)，其分子性質(zhì)也發(fā)生相應(yīng)變化，其分子性質(zhì)以分子場(chǎng)的形式表現(xiàn)。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究中50個(gè)具有梨形四膜蟲細(xì)胞毒性的苯酚類化合物來(lái)自文獻(xiàn)［9］，化合物名稱及其活性見表1，該類化合物的公共結(jié)構(gòu)見圖1。在本研究中，從50個(gè)苯酚類似物中隨機(jī)選擇10個(gè)化合物組成測(cè)試集，用于測(cè)試3D－QSTR模型的預(yù)測(cè)能力；剩余的40個(gè)苯酚類似物則組成的訓(xùn)練集建立3D－QSTR模型。

圖1 苯酚類化合物的公共結(jié)構(gòu)

圖2 苯酚類化合物的分子疊合圖

1.3 分子疊合 本研究以毒性最強(qiáng)的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作為模板，首先對(duì)該化合物進(jìn)行系統(tǒng)搜索及分子力學(xué)優(yōu)化，確定其最低能量構(gòu)象，其他分子則以該分子為模板做結(jié)構(gòu)修飾并進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，最后基于公共結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子疊合。具體步驟為:首先選取活性最強(qiáng)的苯酚類化合物分子，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)構(gòu)象搜索，選擇最低能量構(gòu)象并用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化；然后以該分子為模板構(gòu)建其他分子，并用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化，優(yōu)化的收斂條件均為能量RMS值小于0.05KJ·mol·nm－1。

由于本文研究對(duì)象均為具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的苯酚類化合物，所以認(rèn)為是較剛性的分子，經(jīng)過上述分子力學(xué)優(yōu)化的構(gòu)象即為化合物的活性構(gòu)象，在分子疊合過程中，選擇活性最強(qiáng)的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作為疊合模板，以公共結(jié)構(gòu)（原子1－8）進(jìn)行分子疊合，疊合后的分子骨架見圖2。

1.4 CoMSIA分析 在用CoMSIA分析時(shí)，首先在疊合后的所有分子集合區(qū)產(chǎn)生邊長(zhǎng)為0.2?的格點(diǎn)，并用4?的邊界確定所有疊合分子的區(qū)域。用CoMSIA提供的缺省探針計(jì)算分子在每個(gè)格點(diǎn)上的立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)，在得到每個(gè)格點(diǎn)的分子場(chǎng)后，用偏最小二乘（partial least square，PLS）方法建立分子場(chǎng)參數(shù)與活性的3D－QSTR，并用“留一法”（leave one out，LOO），交互校驗(yàn)（cross validation，CV）方法檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕y(tǒng)計(jì)學(xué)差異以及確定模型的主成分?jǐn)?shù)，以最優(yōu)的交互校驗(yàn)值確定的主成分?jǐn)?shù)并建立非交互校驗(yàn)的3D－QSAR模型，模型質(zhì)量由交互檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)（Q2）、相關(guān)系數(shù)（r2）、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差（standard error prediction，SEP）和F統(tǒng)計(jì)值評(píng)價(jià)。本研究的計(jì)算工作在SGI Fuel工作站用SYBYL6.9完成。

2 結(jié) 果

在本研究中，分別對(duì)訓(xùn)練集化合物的立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)及不同分子場(chǎng)的協(xié)同進(jìn)行CoMSIA分析，各3D－QSTR模型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2；在用PLS方法建立QSAR模型時(shí)，用最優(yōu)Q2確定的主成分?jǐn)?shù)建立非交互校驗(yàn)相關(guān)模型。表2中的模型參數(shù)顯示:使用靜電場(chǎng)與疏水場(chǎng)協(xié)同作用建立的3D－QSAR模型具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和良好的預(yù)測(cè)能力，該模型所用主成分?jǐn)?shù)為4，Q2為0.767，r2為0.933，SEP為0.179，F(xiàn)檢驗(yàn)值為157.914。使用CoMSIA方法分別對(duì)3種分子場(chǎng)建立3D－QSTR模型，其中相關(guān)性最好、預(yù)測(cè)能力最強(qiáng)的是用靜電場(chǎng)所建立的模型（Q2＝0.749，r2＝0.891），其次是用疏水場(chǎng)作用建立的模型，而用立體場(chǎng)（Q2＝0.040，r2＝0.229）預(yù)測(cè)能力相對(duì)較差，說明靜電場(chǎng)對(duì)化合物親和力的影響最明顯。在用任意兩種分子場(chǎng)所建立的模型中，用靜電場(chǎng)與疏水場(chǎng)建立的3D－QSTR模型具有相對(duì)最優(yōu)異的預(yù)測(cè)能力（Q2＝0.767，r2＝0.933）；在該模型中，靜電場(chǎng)對(duì)模型的貢獻(xiàn)為67%；同時(shí)使用3種分子場(chǎng)所建模型中，靜電場(chǎng)的貢獻(xiàn)也達(dá)到59.1%。由此可見，靜電場(chǎng)對(duì)模型的貢獻(xiàn)是非常明顯的，而使用立體場(chǎng)與疏水場(chǎng)的協(xié)同作用則相對(duì)較差。分析表2中的所有QSTR模型可以發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用立體場(chǎng)并不能建立一個(gè)理想的模型，但在有其他分子場(chǎng)存在的情況下立體場(chǎng)作用的貢獻(xiàn)明顯增強(qiáng)。

表1 苯酚類化合物對(duì)四膜蟲細(xì)胞毒性的觀察值與計(jì)算值

表2 苯酚化合物的CoMSIA模型參數(shù)

3 討 論

對(duì)于訓(xùn)練集中，細(xì)胞毒性計(jì)算值與觀測(cè)值的絕對(duì)誤差小于0.335，說明所建立模型具有良好的估計(jì)能力，即靜電場(chǎng)和疏水場(chǎng)與細(xì)胞毒性的相關(guān)性非常好；在測(cè)試集的10個(gè)化合物中，有1個(gè)化合物的預(yù)測(cè)值出現(xiàn)了異常情況，即與觀測(cè)值的偏差比較大，但另外9個(gè)化合物的預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值吻合得比較好，其絕對(duì)誤差最大為0.244。對(duì)于化合物2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚，其預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的絕對(duì)誤差達(dá)到了1.103，這可能是由于化合物中含有2個(gè)空間位阻較大的叔丁基所引起的，也可能是實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值本身存在一定誤差所致或?qū)嶒?yàn)中的偶然誤差引起。

CoMSIA的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是可以分析各種分子場(chǎng)對(duì)毒性的影響，并可以通過3D相關(guān)性等值面圖進(jìn)行觀察；該等值面圖有助于確定影響毒性的分子場(chǎng)重要區(qū)域，也可以標(biāo)記對(duì)活性具有重要貢獻(xiàn)的分子場(chǎng)特征。苯酚類化合物的靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)等值面圖如圖3、4所示。結(jié)合靜電場(chǎng)的等值面圖中（圖3）與具體的化合物進(jìn)行分析可知:在6位（紅色區(qū)域）有相對(duì)較大的基團(tuán)時(shí)，使用負(fù)電性較強(qiáng)的取代基可以增加化合物的毒性，在2、3、5位（藍(lán)色區(qū)域）附近的區(qū)域則應(yīng)該使用正電性較強(qiáng)的取代基。疏水場(chǎng)相關(guān)性等值面圖（圖4）顯示:在分子的2～5位取代位置上都不適合有立體位阻較大的基團(tuán)。

圖3 CoMSIA分析靜電場(chǎng)等值面圖

圖4 CoMSIA分析疏水場(chǎng)等值面圖

Cramer等［13］采用量子化學(xué)方法對(duì)該系列苯酚類化合物進(jìn)行QSTR，作者分別使用AM1、PM3、PM5與DFT方法計(jì)算了苯酚的分子質(zhì)量（Mw）、最高能量軌道（εHOMO）、最低能量軌道（εLOMO）、硬度（η）、柔軟性（S）、化學(xué)勢(shì)（μ）、親電指（ω）數(shù)及總能量（TE），建立了良好的定量結(jié)構(gòu)毒性相關(guān)模型（表3）。盡管本文使用CoMSIA方法所建立的模型與文獻(xiàn)研究結(jié)果相比沒有優(yōu)勢(shì)，但是CoMSIA從三維空間結(jié)構(gòu)討論苯酚類似物的靜電性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)與疏水性質(zhì)對(duì)其細(xì)胞毒性的影響，并可通過分子等勢(shì)面圖為苯酚類似物的設(shè)計(jì)與改造提供直接依據(jù)。

表3 苯酚化合物的定量構(gòu)毒關(guān)系模型對(duì)比

綜上所述，使用靜電場(chǎng)與疏水場(chǎng)建立的3D－QSTR模型，具有良好的穩(wěn)定性與預(yù)測(cè)能力。分子場(chǎng)等值面圖可直觀反映出細(xì)胞毒性有重要影響的重要部位，并可由此推測(cè)在6位上有較大的負(fù)電性基團(tuán)及2～5位上有帶正電荷的取代基對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞毒性有利。將本研究中的3D－QSTR模型與2D－QSTR研究相結(jié)合，對(duì)苯酚類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以改善其細(xì)胞毒性具有重要意義。

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