持續(xù)表達(dá)的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的研究＊

熊江紅，張慶華，張艷妮，朱向東，孔令保

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

病原體感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋的消耗和膜蛋白過(guò)量表達(dá)等能引起從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的信號(hào)傳導(dǎo)途徑即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ER stress response）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以激活3條信號(hào)通路:（1）非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng) （unfolded protein response，UPR）；（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)（ER－overload response，EOR）；（3）固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)（sterol response pathway）［1－2］。

丙型肝炎病毒（HCV）感染容易引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，其致病機(jī)制目前并不很清楚。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白。作者前期的研究發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白4B（NS4B）在宮頸癌細(xì)胞HeLa的持續(xù)表達(dá)和肝癌細(xì)胞Huh7的過(guò)表達(dá)均能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的 UPR途徑［3－4］。在人體內(nèi)HCV感染的主要宿主細(xì)胞是肝細(xì)胞。而且，HCV感染者大部分會(huì)發(fā)展成為持續(xù)性感染，持續(xù)性感染又可進(jìn)一步發(fā)展為肝癌［6］。為調(diào)查NS4B在肝細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)是否也會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以促進(jìn)HCV感染和其致病性，本研究通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染構(gòu)建了持續(xù)表達(dá)NS4B的人肝癌細(xì)胞HepG2，NS4B在HepG2細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)了人X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）mRNA剪接、XBP1和 Grp78啟動(dòng)子激活、Ca2＋穩(wěn)態(tài)變化及核因子κB（NF－κB）激活，表明NS4B可能通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在HCV感染和其致病性中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料 各種工具酶、生化試劑和細(xì)胞培養(yǎng)試劑主要購(gòu)自Promega、Invitrogen、晶美和大連寶生物等公司。NF－κB報(bào)告質(zhì)粒 pNF－κB－Luc購(gòu)自Stratagene公司。人肝癌細(xì)胞系HepG2、大腸桿菌BL21（DE3）、DH5α和 NS4B表達(dá)載體pcDNA3.1（－）NS4B、XBP1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3XBP1pro和GRP78啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3GRP78pro等均由本實(shí)驗(yàn)室保存或以前構(gòu)建［3－4，6］。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和G－418篩選 NS4B表達(dá)載體pcDNA3.1（－）NS4B和空載體pcDNA3.1（－）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和G－418篩選參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.2.2 基因組PCR 收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［7］提取細(xì)胞基因組。以提取的基因組DNA為模板，利用Ex－TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR。使用的引物為NS4B引物對(duì)（正向:5′－GGA TCC TCT AGA ACC ATG GCT CAG CAC TTA CCG TAC－3′；反向:5′－GAA TTC AAG CTT TTA GCA TGG AGT GGT ACA C－3′）或內(nèi)參 GAPDH 引物對(duì)（正向:5′－ATC ACT GCC ACC CAG AAG AC－3′，反向:5′－ATG AGG TCC ACC ACC CTG TT－3′）。0.7%Agarose電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.3 Western blot檢測(cè)NS4B蛋白表達(dá) 收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入裂解液（0.3%NP40，1mmol／L EDTA，50mmol／L Tris－Cl，1%TritonX－100，50mmol／L NaCl，25mmol／L NaF，1 mmol／L Na3VO3，10μg／mL PMSF），冰浴30min，12000g 4℃離心15min，15%聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后使用HCV人陽(yáng)性血清（1∶100）作為為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5000稀釋?zhuān)槎惯M(jìn)行 Western blot分析。蛋白帶的檢測(cè)用化學(xué)發(fā)光光學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。

1.2.4 RT－PCR檢測(cè)XBP1mRNA的剪切 RT－PCR參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行，2.0%瓊脂糖電泳鑒定RT－PCR產(chǎn)物。

1.2.5 熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)GRP78和XBP1啟動(dòng)子活性 使用LipofectaminTM2000將質(zhì)粒pRL－CMV（內(nèi)參）和pGL3 XBP1pro，或者pRL－CMV和pGL3GRP78pro瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。2.5μg／mL Tunicamycin（Tu）處理6h的HepG2細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)（Promega）的操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)NF－κB激活 使用LipofectaminTM2000將NF－κB報(bào)告質(zhì)粒pNF－κB－Luc和內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒pRLCMV（共轉(zhuǎn)染 HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，然后 Ca2＋拮抗劑TMB－8（100μmol／L）處理4h或不處理（陰性對(duì)照）。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)（Promega）的操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 NS4B基因的整合與表達(dá) pcDNA3.1（－）NS4B和空載體pcDNA3.1（－）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的G418抗性HepG2細(xì)胞分別命名為HepG2－4B和HepG2－C細(xì)胞?；蚪MPCR結(jié)果顯示，HepG2－4B細(xì)胞出現(xiàn)780bp的特異性NS4B目的帶，而陰性對(duì)照HepG2－C細(xì)胞未見(jiàn)特異性的NS4B目的帶出現(xiàn)，同時(shí)所有細(xì)胞均檢測(cè)到446bp的GAPDH內(nèi)參帶（圖1a），說(shuō)明在HepG2－4B細(xì)胞中NS4B基因已整合到細(xì)胞基因組。Western blot結(jié)果顯示，HepG2－4B中可以檢測(cè)出27×103的NS4B目標(biāo)帶，而在陰性對(duì)照HepG2－C細(xì)胞中沒(méi)有相應(yīng)的帶，見(jiàn)圖1b。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的鑒定

2.2 RT－PCR檢測(cè)XBP1mRNA的剪切 HepG2－4B細(xì)胞和Tu處理的HepG2細(xì)胞，能夠檢測(cè)到剪切后的PCR產(chǎn)物XBP1（s）和未剪切的PCR 產(chǎn)物 XBP1（u）s mRNA，而在陰性對(duì)照HepG2－C細(xì)胞，只檢測(cè)到XBP1－u（圖2）。同時(shí)所有細(xì)胞均檢測(cè)到GAPDH內(nèi)參帶，說(shuō)明NS4B在HepG2細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)能夠促進(jìn)XBP1mRNA的剪切。

2.3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GRP78和XBP1啟動(dòng)子活性 在Tu處理過(guò)的HepG2細(xì)胞中，GRP78和XBP1啟動(dòng)子活性增高9～12倍。在持續(xù)表達(dá)NS4B的HepG2－4B細(xì)胞中，報(bào)告基因的熒光素酶活性要比對(duì)照HepG2－C細(xì)胞升高6～8倍，見(jiàn)表1。

圖2 RT－RCR檢測(cè)XBP1mRNA的剪切

表1 GRP78和XBP1啟動(dòng)子活性的報(bào)告基因檢測(cè)（n＝3，）

表1 GRP78和XBP1啟動(dòng)子活性的報(bào)告基因檢測(cè)（n＝3，）

組別啟動(dòng)子活性GRP78 XBP1 HepG2 1.00±0.03 1.00±0.02 Tu處理的HepG2 9.00±0.24 12.00±0.56 HepG2－C 1.89±0.07 0.98±0.04 HepG2－4B 6.00±0.22 8.00±0.19

2.4 熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)NF－κB激活 在持續(xù)表達(dá)NS4B的HepG2－4B細(xì)胞中，報(bào)告基因的熒光素酶活性比對(duì)照HepG2－C細(xì)胞升高4.8倍，而Ca2＋拮抗劑 TMB－8（100μmol／L）的處理幾乎完全抑制了HepG2－4B細(xì)胞中的熒光素酶活性升高，見(jiàn)表2。

表2 熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)NF－κB激活（n＝3，）

表2 熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)NF－κB激活（n＝3，）

組別 NF－κB 活性HepG2－C 1.0±0.04 HepG2－4B 4.8±0.15 TMB－8處理的HepG2－4B 1.3±0.11

3 討 論

位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3種跨膜蛋白IRE1、PERK和ATF6已被確認(rèn)為UPR反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的非折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積累時(shí)，GRP78／BIP便與IRE1、PERK、ATF6解離引起這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的激活。激活的IRE1催化XBP1mRNA的剪接，剪接的XBP1mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)其下游基因如GRP78等的表達(dá)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊和降解［1－2］。HCV蛋白質(zhì)的合成和加工，基因組的復(fù)制均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行［8］。HCV復(fù)制子在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)UPR，引起ATF6和GRP78激活，促進(jìn)病毒的復(fù)制［9］。HCV感染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞激活非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，引起GRP78、磷酸化eIF2α、CHOP表達(dá)增加和細(xì)胞凋亡［10］。HCV感染的SCID／Alb－uPA鼠肝內(nèi)，GRP78和Bax表達(dá)增加，肝細(xì)胞出現(xiàn)凋亡癥狀［11］。GRP78激活與肝細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān)［12］。在持續(xù)性感染HCV患者肝內(nèi)，ATF－6、IRE1和PERK激活，活性氧和 NF－κB水平升高［13－14］，顯示在患者體內(nèi)非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)被誘導(dǎo)。與NS4B在宮頸癌細(xì)胞HeLa的持續(xù)表達(dá)和肝細(xì)胞 Huh7的過(guò)表達(dá)類(lèi)似［3－4］。本研究發(fā)現(xiàn)NS4B在肝細(xì)胞HepG2的持續(xù)表達(dá)也能誘導(dǎo)XBP1mRNA剪接、GRP78和XBP1啟動(dòng)子激活。這些結(jié)果揭示NS4B在HCV誘導(dǎo)的UPR、HCV復(fù)制及致癌作用中可能發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)如一些病毒蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致Ca2＋從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，釋放出來(lái)的Ca2＋進(jìn)一步引起 NF－κB激活［1］。表2顯示NS4B在肝細(xì)胞HepG2的持續(xù)表達(dá)引起NF－κB激活，并且這種激活依賴(lài)Ca2＋信號(hào)，說(shuō)明NS4B肝細(xì)胞HepG2的持續(xù)表達(dá)也能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的EOR信號(hào)通路。NF－κB可啟動(dòng)眾多基因轉(zhuǎn)錄，直接參與多種人類(lèi)疾病如炎癥和癌癥的形成發(fā)展［15］。本研究發(fā)現(xiàn)NS4B激活肝細(xì)胞NF－κB揭示NS4B可能在HCV感染引起的炎癥與癌癥中發(fā)揮一定作用。

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