低溫保護劑和降溫速率對豬關(guān)節(jié)軟骨壓縮楊氏模量的影響

呂婭 胥義 孫慧君 王麗萍

(上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海 200093)

引言

關(guān)節(jié)軟骨能為關(guān)節(jié)活動提供低摩擦、低磨損和吸收力學沖擊等重要功能。由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)和淋巴管提供營養(yǎng)，自身修復能力很差，所以一旦損傷后，常常引發(fā)各種關(guān)節(jié)疾病，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。軟骨移植是修復關(guān)節(jié)軟骨損傷的一種非常可靠的治療手段，而有限的關(guān)節(jié)軟骨供體來源及其保存問題，一直是制約關(guān)節(jié)軟骨移植手術(shù)得以推廣的主要原因。近年來，國內(nèi)外許多學者都在探索關(guān)節(jié)軟骨的低溫保存技術(shù)[2-7]，期望能建立關(guān)節(jié)軟骨低溫保存組織庫，為臨床應(yīng)用提供豐富的材料來源，同時也便于醫(yī)生有足夠的時間，進行術(shù)前更準確的尺寸和形狀匹配以及充分的病毒學和細菌學檢測等工作[8]。但 Muldrew等的研究發(fā)現(xiàn)，低溫冷凍軟骨移植后出現(xiàn)了軟骨組織纖維化、軟骨基質(zhì)斷裂以及機械力學性能顯著降低[9-11]。程杰平等也發(fā)現(xiàn)，病變的關(guān)節(jié)軟骨的各項力學性質(zhì)指標均明顯低于正常組的相關(guān)指標[12]。Jomha曾將用于羊關(guān)節(jié)軟骨上還算比較成功的低溫保存方案應(yīng)用于人關(guān)節(jié)軟骨的保存，發(fā)現(xiàn)效果并不理想[13]。

由此看來，盡管人們針對關(guān)節(jié)軟骨進行了大量的深入研究，但從臨床應(yīng)用的角度來講，人類關(guān)節(jié)軟骨的低溫保存技術(shù)遠未成熟，低溫保存過程中的諸多損傷機理還有待進一步探索和研究。從現(xiàn)有的文獻調(diào)研來看，有關(guān)關(guān)節(jié)軟骨低溫保存過程中的生物力學性能變化的研究還很少，其生物力學性能的低溫損傷機理至今不明確，也是目前關(guān)節(jié)軟骨組織尚未完全成功保存的重要原因之一。

為此，筆者采用動態(tài)熱機械分析法(DMA)，系統(tǒng)地研究了低溫保護劑種類、濃度以及降溫速率等對冷凍關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響，有助于深入認識關(guān)節(jié)軟骨低溫保存過程中的生物力學性能損傷機理。

1 實驗設(shè)備與方法

1.1 實驗設(shè)備

1.1.1 動態(tài)熱機械分析儀(DMA)

實驗采用的動態(tài)熱機械分析儀為DMA-Q800(TA，美國)。根據(jù)試驗需要，采用靜態(tài)壓縮模式，預載荷為0.01 N，在37℃恒溫的環(huán)境下，將經(jīng)過預處理后的關(guān)節(jié)軟骨樣品以2 N/min的速率加載至17 N即停止測試。得出應(yīng)力應(yīng)變曲線后，由 DMA自動處理數(shù)據(jù)得到楊氏模量。

1.1.2 程序降溫裝置

實驗采用的程序降溫裝置為自制程序降溫儀，其工作原理是利用液氮容器中液氮蒸汽的縱向溫度梯度，用微機控制微電機的轉(zhuǎn)向和轉(zhuǎn)速，再通過牽引繩來調(diào)節(jié)樣品在液氮蒸汽中的位置，使樣品處于程序所設(shè)置的溫度(-196℃)。本研究模擬慢速降溫和快速降溫，以1℃/min和20℃/min兩種降溫速率從室溫降至-196℃，并恒溫10 min。

1.2 實驗方法

選取上海本地成年豬，取整根有兩瓣半月板覆蓋的白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去，并用專用工具(沖頭)制備直徑為5 mm的軟骨測試樣品。用格林氏液將樣品表面的滑液沖洗掉，再分別置于體積濃度為10%、30%、60%和80%的二甲基亞砜(DMSO)(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)、甘油(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)以及1，2丙二醇(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司，以下簡稱“丙二醇”)中進行2.5 h的充分滲透，即用低溫保護劑將軟骨內(nèi)的水分充分置換。經(jīng)低溫保護劑充分滲透后的樣品用程序降溫儀以1℃/min和20℃/min兩種不同的降溫速率降溫至-196℃，恒溫10 min后，將 -196℃的樣品快速置于37℃恒溫水浴箱中，快速復溫5 min。

將以上方法處理好的樣品分為兩部分，一部分直接用于DMA儀器測量，在降溫速率相同的條件下，分析低溫保護劑的種類和濃度對關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響，此方法稱為方法1;另一部分用pH值為7.4的 PBS，將樣品中的低溫保護劑洗脫，再用DMA儀器測量樣品的楊氏模量，此方法稱為方法2。洗脫是為了排除低溫保護劑的干擾，研究降溫速率對關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響。為了確保實驗數(shù)據(jù)的有效性，每一種實驗條件做3個平行樣。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 低溫保護劑種類及濃度對楊氏模量的影響

如圖1所示，降溫速率為20℃/min時用方法1處理過的樣品的楊氏模量。從圖中可以明顯看出兩個特點：一是在相同的濃度下，DMSO的楊氏模量大于甘油的楊氏模量、大于丙二醇的楊氏模量;二是3種低溫保護劑均隨其濃度的增加，楊氏模量也增加。

圖1 低溫保護劑種類及濃度對楊氏模量的影響Fig.1 Effects of CPA on Young's modulus

在3種低溫保護劑中，DMSO屬于甲基化合物，而甘油和丙二醇屬于羥基化合物。不同類型的低溫保護劑，其保護機理不同。低溫保護劑之所以能夠抑制冰晶的形成與生長，有兩個原因：一個是溶液中的低溫保護劑代替了本該參與相變的水，另一個是由于低溫保護劑分子與水分子之間的相互作用，使其中一部分水成為不凍水或稱結(jié)合水。目前，關(guān)于低溫保護劑保護機理的探討性文章很多，如文獻[14-17]。在尋求新的低溫保護劑時，其結(jié)合水的能力是首先要考察的重要參數(shù)。甲基化合物，一般認為是官能團甲基(—CH3)改變了水分子之間原有的相互作用關(guān)系，形成了結(jié)合水，而自身之間是沒有相互作用的，故而隨濃度的增加，溶液中結(jié)合水的含量呈線性上升。而羥基化合物，一般認為是官能團羥基(—OH)的大部分與水鍵合，形成結(jié)合水，但還有一小部分羥基可以自身鍵合，降低了與水鍵合的機會。因此，甲基或者羥基的含量直接影響著低溫保護劑可以形成的結(jié)合水能力[18]。

如圖2所示，DMSO有2個甲基，甘油有3個羥基，丙二醇有2個羥基和1個甲基。胥義等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度DMSO的未凍水份額比低濃度DMSO的未凍水份額高[19-20]。隨著低溫保護劑濃度的增加，溶液中的甲基或羥基的個數(shù)也增加，結(jié)合水也越多，加之低溫保護劑也代替了降溫時可以產(chǎn)生相變的水的份額，所以當關(guān)節(jié)軟骨加載時，只有較少的自由水從組織內(nèi)部流出，即關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生較小的變形，導致楊氏模量變大。從圖1中可以看到，在3種低溫保護劑中，楊氏模量都隨低溫保護劑濃度的增加而增大。

圖2 3種低溫保護劑的分子式。(a)DMSO;(b)甘油;(c)1-2丙二醇Fig.2 Formula of the three CPA .(a)DMSO;(b)Glycerin;(c)Propylene glycol 1-2

雖然甲基和羥基都可以影響結(jié)合水含量，但這兩種水溶液中有關(guān)結(jié)合水含量的數(shù)據(jù)卻比較缺乏。從圖1中可以看出，在相同濃度下，DMSO的楊氏模量最高，即DMSO的結(jié)合水能力最好，然后依次為甘油、丙二醇。Hey等用DMSO和丙三醇進行了多組對照實驗[21]，發(fā)現(xiàn)45%DMSO和50%甘油在玻璃化轉(zhuǎn)變和反玻璃化趨勢方面有很多共性，這說明在相同的濃度下，DMSO的結(jié)合水能力可能比甘油的結(jié)合水能力要強。文獻[16，22]認為，甲基與甲基之間沒有相互作用，只與水鍵合，而羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，從而降低了結(jié)合水含量。所以，在相同濃度下，DMSO的楊氏模量會明顯大于甘油的楊氏模量，可能是因為DMSO含有2個甲基，而甘油含有3個羥基。這3個羥基除了和水鍵合之外自身也有鍵合，降低了結(jié)合水含量，導致楊氏模量隨之下降。丙二醇與甘油相比，除了有兩個羥基之外還有一個甲基，因此不能籠統(tǒng)地以比較羥基的數(shù)量來決定兩者中哪種低溫保護劑的結(jié)合水能力更強。有可能是甘油代替的自由水份額比丙二醇代替的自由水份額要高，導致甘油溶液中的自由水低于丙二醇，即在相同濃度下甘油的楊氏模量大于丙二醇的楊氏模量。

以上研究均在未洗脫低溫保護劑的條件下進行，而臨床應(yīng)用時，需要將低溫保護劑洗脫才符合移植的最基本條件。下面將進一步討論用PBS洗脫關(guān)節(jié)軟骨中低溫保護劑前后的楊氏模量變化。

2.2 洗脫低溫保護劑后關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量

在降溫速率為20℃/min時，用方法1和方法2處理過的樣品楊氏模量進行對比，如圖3所示。從圖3中可以明顯看出，含有低溫保護劑和低溫保護劑被洗脫后樣品的楊氏模量相差非常大。另外，還注意到，添加了80%DMSO樣品的楊氏模量高于新鮮關(guān)節(jié)軟骨將近52%。

圖3 DMSO經(jīng)PBS洗脫前后關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量Fig.3 Young's modulus of articular cartilage before and after DMSO being eluted by PBS

在經(jīng)過PBS的沖洗置換出軟骨組織內(nèi)DMSO后，關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量與新鮮關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量相比有不同程度的降低，即降溫對力學特性的損傷程度不同。經(jīng) PBS洗脫的這些樣品中，經(jīng)30%DMSO處理與經(jīng)10%DMSO處理的楊氏模量雖然都比新鮮關(guān)節(jié)軟骨的要低，但經(jīng)30%DMSO處理過的樣品楊氏模量要高于經(jīng)10%DMSO處理的樣品的楊氏模量。在10%、30%、60%、80%這4種 DMSO濃度中，以經(jīng)60%DMSO處理過的樣品最接近于新鮮關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量。

經(jīng)過PBS洗脫后，關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量較新鮮軟骨的楊氏模量有所降低，說明即使在有低溫保護劑的情況下，仍然會造成關(guān)節(jié)軟骨較大的生物力學性能損傷。因此，要實現(xiàn)完整關(guān)節(jié)軟骨的理想保存，尋找一種合適的低溫保護劑及其合適的濃度是非常迫切的。下面討論降溫速率對楊氏模量的影響，均是洗脫低溫保護劑后的測試結(jié)果。

2.3 降溫速率對楊氏模量的影響

圖4所示為方法2處理過的樣品的楊氏模量，虛線部分為新鮮關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量?？梢悦黠@看出，即使添加了各種低溫保護劑，經(jīng)過凍存后關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量與新鮮關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量相比，還是有不程度的降低;在相同的低溫保護劑濃度下，降溫速率為1℃/min的楊氏模量比較接近新鮮關(guān)節(jié)軟骨。這說明，慢速降溫對關(guān)節(jié)軟骨的生物力學特性造成的損傷小。

圖4 降溫速率對關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響。(a)甘油;(b)丙二醇;(c)DMSOFig.4 Effects of cooling rates on Young's modulus(a)Glycerin;(b)Propylene glycol;(c)DMSO

機械效應(yīng)是由細胞內(nèi)冰晶生長而產(chǎn)生的機械力量引起的，且慢速冷凍產(chǎn)生的冰晶較大、快速冷凍產(chǎn)生的冰晶較小。降溫速率越大，成核率也越大，形成數(shù)量很多的小冰晶，但冰晶生長率相對較低;而降溫速率越小，則相反[23-24]。關(guān)節(jié)軟骨這種特殊的組織是由少量的軟骨細胞和大量的細胞外基質(zhì)組成的，細胞主要作用是合成和分泌基質(zhì)蛋白，維持軟骨基質(zhì)的新陳代謝，而細胞外基質(zhì)是軟骨的主要力學承載者。當降溫速率較小時，細胞外水分首先結(jié)晶，造成游離水分子減少，細胞內(nèi)水分由于滲透壓不平衡而外滲，細胞收縮，細胞外形成的冰晶損傷了蛋白多糖或者膠原纖維。當降溫速率較大時，軟骨細胞內(nèi)外冰晶體形成的速度較快，細胞內(nèi)水分尚未轉(zhuǎn)移到細胞外，細胞內(nèi)外同時結(jié)晶。細胞內(nèi)冰晶對細胞的損傷體現(xiàn)在細胞質(zhì)和細胞核，影響的是軟骨細胞的分裂能力;而細胞外降溫時的成核率較低，冰晶生長速度較快，形成的大量冰晶迅速引起宏觀體積膨脹，且冰晶之間大量存在的空隙也增加了宏觀體積的膨脹，破壞了膠原纖維的合理排列分布，使軟骨的支架結(jié)構(gòu)受到破壞，大大降低了軟骨的力學承載能力。

從圖4中也可以看出，當降溫速率太大時，形成的冰晶對軟骨細胞外基質(zhì)(即蛋白多糖或者膠原纖維)的損傷導致了軟骨的模量的下降，而軟骨的楊氏模量體現(xiàn)了軟骨負重能力。另外，形成的冰晶對細胞膜的破壞也是很大的，可以直接造成細胞死亡。所以，找到適合的降溫速率對于凍存軟骨是非常重要的。

3 結(jié)論

本研究對3種低溫保護劑、4種低溫保護劑濃度以及2種降溫速率對關(guān)節(jié)軟骨楊氏模量的影響進行了實驗，結(jié)果表明：

1)隨著3種低溫保護劑濃度的增大，楊氏模量也隨之升高。這是因為隨著低溫保護劑濃度的增加，溶液中的甲基或羥基的個數(shù)也增加，結(jié)合水也增多，相對的自由水減少，所以當關(guān)節(jié)軟骨加載時，只有較少的自由水流出組織產(chǎn)生較小的變形，導致楊氏模量變大。

2)相同的低溫保護劑濃度，3種低溫保護劑中DMSO的楊氏模量最高，其次是甘油，丙二醇的楊氏模量最低。DMSO有2個甲基，甘油有3個羥基，丙二醇有2個羥基和1個甲基，而甲基與甲基之間沒有相互作用，只與水鍵合，而羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，從而降低了結(jié)合水含量。

3)慢速降溫的關(guān)節(jié)軟骨的楊氏模量大于快速降溫軟骨的楊氏模量，這是因為快速冷凍產(chǎn)生的冰晶生長速度較快，形成的大量冰晶迅速引起宏觀體積膨脹。這種宏觀膨脹破壞了膠原纖維的合理排列分布，使軟骨的支架結(jié)構(gòu)受到破壞，大大降低了軟骨的力學承載能力。

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