殼聚糖對人子宮內(nèi)膜癌細胞影響的實驗研究

呂 芳 潘 宇 魏 勉 顧方樂 王大新 張曉梅

江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心(揚州，225001)

隨著體內(nèi)支架植入術(shù)的廣泛應(yīng)用，近年已經(jīng)研制出多種藥物涂層支架，在支架外可涂覆一層膜使藥物緩慢釋放，達到治療和預(yù)防目的，避免了二次手術(shù)給患者帶來的痛苦［1］。殼聚糖是天然多糖，無毒無刺激，具有良好的組織相容性和生物可降解性，在體內(nèi)可被溶菌酶緩慢催化水解為低聚糖被人體吸收，是一種新型的醫(yī)用生物材料，應(yīng)用于體內(nèi)安全［2，3］。殼聚糖做為一種生物可降解納米緩釋聚合物的出現(xiàn)，為宮內(nèi)節(jié)育產(chǎn)品的材質(zhì)設(shè)計提供了新契機。體外實驗和動物實驗表明殼聚糖具有選擇性抑制成纖維細胞、平滑肌細胞增殖［4］和促進表皮細胞［5］、內(nèi)皮細胞的生長［6］，但對人子宮內(nèi)膜細胞的影響尚未見文獻報道。本實驗旨在研究殼聚糖在體外環(huán)境下對人子宮內(nèi)膜細胞的影響，為殼聚糖作為宮內(nèi)節(jié)育器材料提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基(sigma公司，美國)、胰蛋白酶(difco公司，美國)、胎牛血清(hyclone公司，美國)、阿霉素(浙江海正藥業(yè)公司)、噻唑藍(MTT，sigma公司，美國)、殼聚糖(濟南海得貝海洋生物工程有限公司)、碘化丙錠(BD公司，美國)、5－溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，sigma公司，美國)。細胞增殖ELISA試劑盒(Roche公司，瑞士)、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株(上海復(fù)祥生物科技有限公司)，分光光度計(Shimadzu公司，日本)，流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖溶液配制取殼聚糖干粉2.0g，加入蒸餾水100ml，再加入冰醋酸1ml，磁力攪拌24h，待殼聚糖完全溶解后，10 000rpm/min離心20min，取上清，得到濃度為20 000μg/ml的殼聚糖儲存液。使用RPMI 1640培養(yǎng)液配制最終濃度為0.01、0.1、1、10、50、100μg/ml的殼聚糖工作液。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組處理Ishikawa細胞使用10%胎牛血清 －RPMI 1640培養(yǎng)基，以1×104細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，每2天更換新鮮培養(yǎng)基。收集處于對數(shù)生長期的細胞，培養(yǎng)24h后進行分組處理。細胞中分別添加不同濃度殼聚糖溶液培養(yǎng)做為實驗組;分別以20%胎牛血清和5μg/ml阿霉素溶液進行培養(yǎng)為陽性對照組，常規(guī)培養(yǎng)細胞為空白對照組。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后進行實驗測試。

1.2.3 細胞增殖檢測采用MTT法檢測細胞增殖。在培養(yǎng)細胞中加入20μl的MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄MTT溶液，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，570nm波長，分光光度計檢測光吸收值，每組重復(fù)3次。計算細胞相對增殖率［(各組細胞光密度值/空白對照組細胞光密度值)×100］;分析細胞增殖率和細胞毒性分級［7］，當(dāng)相對細胞增值率值分別為≥100%、75% ～99%、50% ～74%、25% ～49%、1% ～24%、0時，毒性反應(yīng)分別為0級、1級、2級、3級、4級、5級。0級和1級為無毒性，3級～5級為有毒性，2級時結(jié)合細胞形態(tài)觀察判定有無毒性。

1.2.4 細胞DNA合成速率檢測采用BrdU摻入法進行DNA合成速率的檢測。在各組培養(yǎng)細胞中加入10μM BrdU，孵育8h后，分光光度計450nm波長檢測光吸收(OD)值，每組重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 細胞周期的檢測方法收集各組培養(yǎng)細胞，離心后棄上清，PBS洗3次，300μl PBS重懸細胞，加入700μl預(yù)冷無水乙醇，3 000rpm/min離心5min，棄上清，加入800μl碘化丙錠(PI)，輕輕混勻，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 殼聚糖對細胞增殖和細胞毒性的影響

不同濃度殼聚糖處理細胞48h后，與空白對照組比較，細胞的增殖能力在殼聚糖濃度≤10μg/ml的各組無明顯變化(P＞0.05)，在50μg/ml組和100μg/ml組具有促進作用(t=2.423，P=0.036 和t=5.520，P=0.002);在 20% 胎牛血清組細胞增殖率增加(t=3.023，P=0.020)，在阿霉素組則降低(t=78.15，P＜0.01)。分析細胞毒性分級顯示，殼聚糖和胎牛血清組均無細胞毒性產(chǎn)生，阿霉素具有明顯的細胞毒性。見表1。

2.2 殼聚糖對細胞DNA合成速率的影響

由表1可見，與空白對照組比較，殼聚糖濃度≤10μg/ml的4組和20%胎牛血清組細胞的DNA合成速率均無差異(P＞0.05);殼聚糖濃度為50μg/ml和100μg/ml時對細胞內(nèi)DNA合成具有促進作用(t=3.605，P=0.011;t=4.338，P=0.006);阿霉素組 DNA 明顯受到抑制(t=13.902，P ＜0.01)。

2.3 殼聚糖對細胞周期的影響

根據(jù)細胞增殖能力影響結(jié)果，當(dāng)殼聚糖濃度≤10μg/ml時細胞增值率無明顯變化，≥50μg/ml殼聚糖對細胞增殖具有明顯促進作用。為了進一步評估殼聚糖對細胞活性的影響，選擇殼聚糖濃度≤10μg/ml的4組細胞進行細胞周期分析，結(jié)果見圖1。與空白對照組和20%胎牛血清陽性對照組比較，≤10μg/ml殼聚糖4組G1期、G2期、S期的細胞均無明顯變化(P＞0.05)，各期細胞所占比率分別在46.36% ～49.52%、11.76% ～16.36%、37.22% ～40.15%;阿霉素組G1期和 G2期明顯延長，分別占59.1%和40.9%，而S期細胞極低。表明殼聚糖濃度≤10μg/ml時對細胞周期沒有明顯影響。

表1 各組細胞增殖率及毒性結(jié)果(±s)

表1 各組細胞增殖率及毒性結(jié)果(±s)

與空白對照組比較*P＜0.05 ＊＊P＜0.01

組 別 細胞增殖率OD值%毒性分級 DNA合成速率OD值空白對照組 1.154 ±0.019 100.0 0 級0.731 ±0.0721殼聚糖實驗組(μg/ml)0.01 1.172 ±0.044 101.6 0 級 0.713 ±0.056 0.1 1.144 ±0.065 99.1 1 級 0.787 ±0.010 1.0 1.191 ±0.054 103.2 0 級 0.744 ±0.014 10 1.203 ±0.040 104.2 0 級 0.789 ±0.016 50 1.230 ±0.050* 106.5 0 級 0.919 ±0.055*100 1.289 ±0.038＊＊ 111.7 0 級 0.964 ±0.059＊＊胎牛血清陽性對照組 1.421±0.151* 123.1 0級 0.718±0.060阿霉素組 0.286±0.005＊＊ 24.8 3級 0.145±0.011＊＊

圖1 殼聚糖對細胞周期影響的變化曲線

3 討論

殼聚糖是利用蝦蟹外殼廢棄物質(zhì)制成的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性，在人體內(nèi)可被完全吸收，無毒副作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［8］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖具有優(yōu)良的藥劑輔料性質(zhì)，如生物相容性、可降解性、吸濕性等，并且殼聚糖本身具有一定的抗菌、消炎、止血等作用，因此在藥物制劑中的應(yīng)用越來越廣泛［9］。

Ishikawa細胞具有子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞的混合特征，被認為是研究正常子宮內(nèi)膜功能的良好模型［10］。并且Ishikawa細胞表達與正常子宮內(nèi)膜相同的許多酶和結(jié)構(gòu)蛋白［11］，這些分子隨著功能性類固醇類激素受體的變化而變化，因此Ishikawa細胞可以用于人子宮內(nèi)膜內(nèi)分泌信號通路的相關(guān)研究［12］。

本研究首先通過MTT檢測了殼聚糖對Ishikawa細胞毒性的影響，其次使用BrdU摻入法和流式細胞儀檢測殼聚糖對Ishikawa細胞周期的變化。實驗結(jié)果顯示，殼聚糖濃度≤100μg/ml時對Ishikawa細胞均無明顯的細胞毒性;≤10μg/ml對Ishikawa細胞的增殖生長、DNA合成與細胞周期均無明顯影響應(yīng)，既不引起子宮內(nèi)膜異常增殖，也不抑制子宮內(nèi)膜細胞增殖。將殼聚糖用于IUD生物緩釋載藥材料將有望為開發(fā)出新一代生物降解型載藥聚合物宮內(nèi)節(jié)育器產(chǎn)品帶來新的選擇。

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