宮清方誘導(dǎo)Th1/Th2亞群漂移減輕藥物流產(chǎn)后子宮出血動物研究

李 霞 王永紅 王 麗 趙向忠 周憲賓 郭鈺琪 姜國勝 姚成芳，*

1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所(濟(jì)南，250062);2.山東省肥城市中醫(yī)院婦產(chǎn)科

藥物流產(chǎn)因其簡便、痛苦小等優(yōu)點成為目前終止非意愿妊娠的首選方式，但流產(chǎn)后異常子宮出血一直是臨床上難以解決的問題。藥物流產(chǎn)存在6%～10%的大出血危險，其中約1% ～3%的病例因大出血而需急救處理［1］，我們前期的臨床觀察也證實藥物流產(chǎn)子宮出血量明顯高于負(fù)壓吸引流產(chǎn)術(shù)［2，3］。藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，隨著生殖免疫研究的不斷深入，免疫機(jī)制在其中的作用受到更多關(guān)注。Th1/Th2亞群漂移在妊娠中的重要作用已充分證實［4］，但其漂移狀態(tài)與藥物流產(chǎn)后子宮出血之間的關(guān)系尚未明確，對其深入探索有望進(jìn)一步揭示藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的發(fā)病機(jī)制，為治療提供新的靶點。宮清方是長期應(yīng)用于臨床減輕藥物流產(chǎn)子宮出血的有效方劑，已獲國家藥品監(jiān)督管理局新藥臨床研究批件，并順利完成Ⅱ期臨床研究。本研究探討Th1/Th2亞群漂移與藥物流產(chǎn)后子宮出血量間的相關(guān)性以及宮清方靶向誘導(dǎo)Th1/Th2亞群漂移減輕藥物流產(chǎn)后子宮出血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Balb/C小鼠(山東大學(xué)實驗動物中心提供)，10周齡，體重(22±2)g，雌性小鼠未交配過且證明有生育能力。置于室溫24℃，相對濕度60%～65%的超凈動物飼養(yǎng)柜內(nèi)，雌雄分籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

米非司酮由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)。宮清方由益母草、馬齒莧、黨參、生蒲黃、川牛膝、枳殼、仙鶴草、當(dāng)歸、川芎、甘草，按10:10:6:6:6:6:5:3:3:2比例組成，常規(guī)法水煎、醇沉，回收乙醇，滅菌后4℃冰箱保存，用于小鼠灌胃給藥。

1.3 試劑與儀器

大鼠抗小鼠熒光抗體:藻紅蛋白－Cy5(PC5)－CD3、異硫氰酸熒光素 (FITC)－CD4、藻紅蛋白(PE)－IFN－γ，PE－白細(xì)胞介素(IL)－4均購自美國BD公司。內(nèi)參照β－肌動蛋白(β－actin)、IFN－γ、IL－4引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，。IFN－γ上游引物序列:CAGCTGATCCTTTGGACCCTC，下游引物序列:CCTTTTGCCAGTTCCTCCAGA。IL－4上游引物序列:TAG TTG TCA TCC TGC TCTT，下游引物序列:GTC TTT CAG TGA TGT GGAC。β－actin為內(nèi)參照，上游引物序列:GGCACCACACCTTCTACAATG，下游引物序列:ACGCACGATTTCCCTCTCAG。FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自Becton Dickinson公司;梯度PCR擴(kuò)增儀(TGradient)購自德國 Biometra公司;凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Imager TM 2200)購自美國Alpha公司;電泳儀購自美國Thermo公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組雌雄小鼠按2∶1合籠，次日清晨發(fā)現(xiàn)陰道栓記為妊娠第1天。孕鼠20只隨機(jī)分為米非司酮大、小劑量組各10只，從妊娠第6天開始，分別灌胃米非司酮橄欖油溶劑 1.5mg/kg·d、0.88mg/kg·d，連續(xù)用藥3天，分別得到70%及55%完全流產(chǎn)率［5］。另取孕鼠40只隨機(jī)分為米非司酮組、宮清方大、中、小劑量組各10只，從妊娠第6天開始，米非司酮組灌胃米非司酮橄欖油溶劑1.5mg/kg·d，連續(xù)用藥3天;宮清方大、中、小劑量組米非司酮用藥方法同米非司酮組，從妊娠第6天開始，分別灌胃宮清方提取液308.16mg/kg·d、154.08mg/kg·d、77.04mg/kg·d，連續(xù)用藥 5d。

1.4.2 標(biāo)本收集自藥物處理第1天起，小鼠陰道內(nèi)置入20g定量棉球，每日更換，置于密閉EP管內(nèi)，4℃保存，改良堿性正鐵血紅素法檢測小鼠子宮出血量［6］。妊娠第11天從小鼠眼眥取血，頸椎脫臼處死。分離子宮組織剪至1mm×1mm大小，200目銅網(wǎng)研磨過濾，1×PBS沖洗，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離子宮組織單個核細(xì)胞，分別用于流式抗體標(biāo)記與逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)檢測。

1.4.3 流式抗體標(biāo)記調(diào)整子宮組織單個核細(xì)胞濃度(1×106個/mL)，加入佛波酯(30ng/mL)、離子霉素(1μg/mL)、莫能霉素(1.7ng/mL)，37℃、5%C02孵育4h。收集細(xì)胞，1×PBS洗2遍，加入大鼠血清，室溫避光孵育30min。將外標(biāo)抗體(PC5－CD3、FITC－CD4)按說明書分別加入到細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30min;1×PBS洗2次。BD固定穿膜試劑盒固定穿膜(按說明書操作)，加入內(nèi)標(biāo)抗體(PE－IFN－γ，PE－IL－4)，4℃避光孵育30min。穿膜緩沖液洗2次，1×PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)管，上機(jī)檢測。Winmidi 2.9 分析 Th1 亞群(CD3+、CD4+、IFN －γ+)及 Th2亞群(CD3+、CD4+、IL －4+)比例。

1.4.4 RT－PCR檢測引物使用Primer 5.0設(shè)計，異硫氰酸胍一步法提取子宮組織單個核細(xì)胞總RNA，按RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，25 μl總反應(yīng)體系進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，退火溫度58℃ ～60℃。1.5%凝膠(EB染色)水平電泳，采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析分析圖像:以β－actin為內(nèi)參照，計算目的基因與同步β－actin灰度值比值作為相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮出血量與Th1/Th2亞群漂移相關(guān)性

與米非司酮小劑量組比較，米非司酮大劑量組藥物流產(chǎn)小鼠子宮出血量減少(P＜0.05)，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，米非司酮大劑量組藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面Th1亞群(CD3+、CD4+、IFN－γ+)比例升高(P ＜0.05)，Th2 亞群(CD3+、CD4+、IL －4+)比例降低(P＜0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，子宮出血量與 Th1亞群比例負(fù)相關(guān)(r=－0.604，P＜0.05)，與 Th2亞群比例正相關(guān)(r=0.550，P＜0.05)，與 Th1/Th2比值負(fù)相關(guān)(r=－0.623，P＜0.05)。見表1。

表1 不同藥物劑量組流產(chǎn)小鼠子宮出血量及Th1/Th2亞群變化比較(±s)

表1 不同藥物劑量組流產(chǎn)小鼠子宮出血量及Th1/Th2亞群變化比較(±s)

Th1/Th2米非司酮小劑量組 10 27.10 ±3.82 13.29 ±2.43 4.40 ±1.01 3.20 ±1.26組別 例數(shù) 子宮出血量(μl)Th1亞群占CD3+CD4+細(xì)胞比例(%)Th2亞群占CD3+CD4+細(xì)胞比例(%)米非司酮大劑量組 10 20.89 ±3.20 17.05 ±3.21 3.39 ±0.64 5.28 ±1.73

2.2 宮清方對子宮出血量及兩細(xì)胞亞群的作用

與米非司酮單獨作用比較，米非司酮聯(lián)合宮清方作用后小鼠子宮出血量減少(P＜0.05)，且與宮清方藥物濃度呈劑量依賴性(P＜0.05);小鼠母胎界面Th1亞群比例升高(P＜0.05)，Th2亞群比例降低(P ＜0.05)，Th1/Th2升高(P ＜0.05)，提示宮清方減輕藥物流產(chǎn)小鼠子宮出血量作用呈劑量依賴性。見表2。

表2 不同藥物劑量組流產(chǎn)小鼠子宮出血量及Th1/Th2亞群變化比較(±s)

表2 不同藥物劑量組流產(chǎn)小鼠子宮出血量及Th1/Th2亞群變化比較(±s)

Th1/Th2米非司酮組 10 20.25 ±4.33 16.89 ±4.21 3.24 ±0.74 5.03 ±1.67組別 例數(shù) 子宮出血量(μl)Th1亞群占CD3+CD4+細(xì)胞比例(%)Th2亞群占CD3+CD4+細(xì)胞比例(%)宮清方小劑量組 10 16.30 ±3.44 19.42 ±4.47 2.77 ±0.66 7.01 ±2.13宮清方中劑量組 10 14.42 ±3.60 23.06 ±4.91 2.18 ±0.63 10.57 ±2.78宮清方大劑量組 10 10.71 ±3.74 28.70 ±5.28 1.34 ±0.51 17.43 ±2.49

2.3 宮清方對藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4轉(zhuǎn)錄水平的影響

與米非司酮組比較，米非司酮聯(lián)合宮清方作用后，Th1亞群特征性細(xì)胞因子IFN－γ mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，Th2亞群特征性細(xì)胞因子IL－4 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)(圖6)，提示宮清方通過上調(diào)Th1亞群特征性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平、下調(diào)Th2亞群特征性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th1亞群漂移。見表3。

3 討論

妊娠類似于成功的半同種異體移植，免疫系統(tǒng)進(jìn)行著復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控，誘導(dǎo)與維持母胎免疫耐受狀態(tài)。T細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的主導(dǎo)因素，初始T細(xì)胞遇抗原刺激后在特異性核轉(zhuǎn)錄因子與分化誘導(dǎo)因子作用下，分化為Th1、Th2等亞群，分泌特征性細(xì)胞因子，主導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。Th1類細(xì)胞因子IFN－γ抑制絨毛膜促性腺激素的分泌，誘導(dǎo)蛻膜、絨毛細(xì)胞凋亡和母胎免疫排斥，誘導(dǎo)流產(chǎn);Th2類細(xì)胞因子IL－4降低巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性和淋巴毒素作用，使胚胎逃逸母體免疫排斥，有利于妊娠［7］。Th1亞群與Th2亞群通過對立調(diào)節(jié)模式限制彼此免疫應(yīng)答強(qiáng)度，維持妊娠母胎免疫耐受與免疫排斥的平衡。正常妊娠時Th1/Th2平衡向Th2漂移，有利于母胎免疫耐受的形成與維持［8］，而Th1類細(xì)胞因子的優(yōu)勢表達(dá)則打破母胎免疫耐受狀態(tài)而導(dǎo)致流產(chǎn)［9］。

表3 各組藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

表3 各組藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

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藥物流產(chǎn)子宮出血量多、出血時間長是臨床常見的副反應(yīng)，其防治成為研究的重點與難點。動物實驗證實，米非司酮能優(yōu)勢誘導(dǎo)妊娠小鼠Th1類細(xì)胞因子表達(dá)，抑制Th2類細(xì)胞因子表達(dá)［10］。臨床研究亦證實米非司酮藥物流產(chǎn)存在Th1/Th2向Th1亞群偏移，提示Th1/Th2亞群漂移在米非司酮藥物流產(chǎn)中扮演了重要角色［11，12］，但 Th1/Th2 亞群漂移狀態(tài)與藥物流產(chǎn)后子宮出血量之間的相關(guān)性尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮大劑量藥物流產(chǎn)小鼠較小劑量組子宮出血量明顯減少，Th1亞群比例升高，Th2亞群比例降低，Th1/Th2比值升高。相關(guān)性分析顯示，子宮出血量與Th1亞群比例及Th1/Th2比值負(fù)相關(guān)，與Th2亞群比例正相關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實Th1/Th2亞群漂移參與了米非司酮藥物流產(chǎn)子宮出血的發(fā)生，Th1/Th2亞群漂移狀態(tài)與子宮出血量密切相關(guān)，靶向誘導(dǎo)Th1/Th2向Th1亞群漂移的方法可能減輕藥物流產(chǎn)后子宮出血。

藥物流產(chǎn)后異常子宮出血屬中醫(yī)學(xué)“產(chǎn)后惡露不絕”范疇，“瘀、虛、熱”是本病的主要病機(jī)，活血祛瘀是治療本病的關(guān)鍵，瘀去而血行，養(yǎng)血益氣是治療本病的基礎(chǔ)。宮清方具有清熱化瘀、益氣養(yǎng)血的功效，臨床研究證實，該復(fù)方能顯著縮短藥物流產(chǎn)后子宮出血時間，減少子宮出血量，但其干預(yù)靶點及關(guān)鍵作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究顯示，宮清方可通過上調(diào)米非司酮藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面Th1亞群特征性細(xì)胞因子IFN－γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平，同時下調(diào)Th2亞群特征性細(xì)胞因子IL－4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1/Th2向Th1亞群漂移，進(jìn)而介導(dǎo)母胎免疫排斥，減輕流產(chǎn)后子宮出血。

中醫(yī)藥治療婦科血癥具有療效確切、副作用小、價格低廉等優(yōu)點。米非司酮藥物流產(chǎn)中Th1/Th2亞群漂移狀態(tài)與子宮出血量密切相關(guān)，宮清方通過優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1亞群漂移促進(jìn)母胎免疫排斥，減輕藥物流產(chǎn)后子宮出血，但導(dǎo)致米非司酮藥物流產(chǎn)中T細(xì)胞亞群漂移的始動因素尚未明確，對其深入探討有望進(jìn)一步闡釋藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的發(fā)病機(jī)理及中藥減輕藥物流產(chǎn)后子宮出血的作用機(jī)制，為新藥研發(fā)及臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

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