紫外誘變選育β-呋喃果糖苷酶高產(chǎn)菌株及培養(yǎng)基優(yōu)化

馬歌麗 韓甜甜

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)又稱蔗糖酶或轉(zhuǎn)化酶，具有廣泛的受體特性。在低濃度的蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶主要催化蔗糖水解生成果糖和葡萄糖；在高濃度的蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶可催化轉(zhuǎn)糖基作用，在蔗糖的果糖基上通過(guò)β-2，1糖苷鍵連接1～3個(gè)果糖而形成低聚果糖；β-呋喃果糖苷酶也能以蔗糖和乳糖為底物，將蔗糖分子中的果糖基優(yōu)先轉(zhuǎn)移到乳糖分子上，催化合成低聚乳果糖。除此之外，β-呋喃果糖苷酶還能催化合成糖苷類化合物、生產(chǎn)β-寡聚葡萄糖等[1]。

β-呋喃果糖苷酶廣泛存在于生物界，主要來(lái)源于節(jié)桿菌、酵母菌、黑曲霉、米曲霉、日本曲霉等微生物[2-6]，但現(xiàn)有菌株產(chǎn)生β-呋喃果糖苷酶的活力普遍較低，因此，選育高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶菌株具有實(shí)際意義。本試驗(yàn)對(duì)黑曲霉進(jìn)行紫外誘變，篩選出高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶突變菌株；并采用單因素和響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)該突變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉由鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆20%、蔗糖2%、瓊脂1.5%～2%。

初篩培養(yǎng)基：土豆20%、蔗糖2%、瓊脂1.5%～2%。

種子培養(yǎng)基:蔗糖3%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、NaNO30.3%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO4·7H2O 0.001%，pH值自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、NaNO30.3%、MgSO4·7H2O 0.05%、MnCl2·4H2O 0.03%、FeSO4·7H2O 0.001%，pH 值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫外誘變

1.2.1.1 黑曲霉孢子懸液的制備

將保存的黑曲霉菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，待孢子成熟時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水洗掉孢子，制成孢子濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液。

1.2.1.2 紫外誘變處理

取制備好的孢子懸液5 ml于直徑9 cm的平皿中，將平皿置于距離30 W紫外燈30 cm的升降臺(tái)上，進(jìn)行不同時(shí)間的照射處理。對(duì)每個(gè)處理樣品進(jìn)行梯度稀釋，取每個(gè)稀釋度的樣品0.2 ml涂布于初篩固體平板上，30℃培養(yǎng)。以未經(jīng)紫外線照射的孢子懸液作對(duì)照。

1.2.2 誘變菌株的篩選

將誘變處理的菌株30℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率。以致死率在70%～85%的照射量為參考，挑取篩選平板上長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后接種到液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，再以3%的接種量接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的酶活。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選得到的高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶突變菌株在斜面上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳5代，對(duì)每一代菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的酶活，檢測(cè)突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別改變培養(yǎng)基的碳源和氮源，以3%的接種量，在30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的酶活；再以最佳碳源和氮源為培養(yǎng)基的基本成分，在培養(yǎng)基中分別加入不同種類的金屬離子，以未加金屬離子的培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液的酶活。

響應(yīng)面分析優(yōu)化培養(yǎng)基：以發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力影響較大的3個(gè)因素為自變量，β-呋喃果糖苷酶活力為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1.2.5 酶活測(cè)定

酶活定義：在35℃、pH值5.0的條件下，以每分鐘催化10%的蔗糖產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)β-呋喃果糖苷酶活力單位(U)，用U/ml表示。

酶活測(cè)定原理：DNS（3，5-二硝基水楊酸）與還原糖共熱后被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在波長(zhǎng)540 nm處3-氨基-5-硝基水楊酸有較強(qiáng)的光吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)液的吸光度值與還原糖的量成正比，即反應(yīng)液的吸光度值與β-呋喃果糖苷酶的活力成正比。

酶活測(cè)定步驟：發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后得上清液，即為粗酶液。將粗酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取0.5 ml 10%蔗糖溶液（用pH值5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制）和0.5 ml粗酶稀釋液，于35℃水浴中反應(yīng)20 min，沸水浴中10 min，冷卻后加1 ml DNS溶液，混勻，沸水浴3 min，加8 ml蒸餾水，混勻。以蒸餾水作為空白對(duì)照。測(cè)定反應(yīng)液在540 nm處的吸光度值，由OD540nm從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到還原糖的濃度，進(jìn)而計(jì)算出樣品的酶活。酶活計(jì)算公式：

式中：m——還原糖濃度(mg/ml)；

180 ——葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量；

t——反應(yīng)時(shí)間(min)；

v——酶液量(ml)；

n——稀釋倍數(shù)。

1.2.6 生物量測(cè)定

發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)真空抽濾，菌體和濾紙一起置于70℃干燥箱烘干至恒重，總重與濾紙之差為菌體干重，由此計(jì)算得到單位體積培養(yǎng)液的菌體干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變選育高產(chǎn)菌株

2.1.1 致死率曲線

對(duì)黑曲霉孢子懸液進(jìn)行不同時(shí)間的紫外照射處理，經(jīng)固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，紫外誘變的致死率曲線如圖1所示。

圖1 紫外照射黑曲霉孢子致死率曲線

從圖1可知，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉孢子的致死率逐漸增大。當(dāng)紫外照射時(shí)間小于2 min時(shí)，黑曲霉孢子的致死率小于70%；當(dāng)紫外照射時(shí)間大于3 min時(shí)，黑曲霉孢子的致死率大于85%。工業(yè)育種時(shí)一般以致死率在70%～85%的照射劑量為誘變育種的參考量。因此，本試驗(yàn)確定紫外照射時(shí)間為2.5 min。

2.1.2 高產(chǎn)誘變株的篩選及穩(wěn)定性檢驗(yàn)

挑選經(jīng)紫外照射2.5 min平板上生長(zhǎng)良好，形態(tài)較大的菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，最終選取20株接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的酶活，結(jié)果見表1。

表1 紫外照射2.5 min菌株的產(chǎn)酶活力

由表1可知，經(jīng)紫外照射2.5 min后，20株菌中有11株菌的產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力得到提高，9株菌的產(chǎn)酶活力下降，其中突變株YA03的酶活力提高最多,其產(chǎn)酶活力為3.75 U/ml，是出發(fā)菌株的1.66倍。

將黑曲霉突變株YA03連續(xù)5次傳代培養(yǎng)，其發(fā)酵液產(chǎn)酶活力如表2所示。

表2 黑曲霉突變株YA03穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表2可以看出，黑曲霉突變株YA03經(jīng)5代培養(yǎng)后其產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力變化不大，表明突變株YA03具有良好的遺傳穩(wěn)定性，為有效突變菌株，可以作為進(jìn)一步的試驗(yàn)菌株。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別用5%的不同碳源代替蔗糖作為唯一碳源，碳源種類對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶酶活力和生物量的影響結(jié)果見表3。

由表3可知，黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活性和生物量受碳源的影響均比較顯著。以蔗糖、葡萄糖和果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基均有利于微生物生長(zhǎng)；以蔗糖為唯一碳源時(shí)，黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的活力最高，為3.98 U/ml。因?yàn)棣?呋喃果糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，底物蔗糖可同時(shí)作為果糖基的供體和受體，所以蔗糖的存在對(duì)β-呋喃果糖苷酶的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用。由此可以確定蔗糖仍為最佳碳源。

表3 碳源種類對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶活力和生物量的影響

2.2.2 碳源濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶的影響

以蔗糖為唯一碳源，改變培養(yǎng)基中的蔗糖濃度，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液的酶活及生物量，蔗糖濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶酶活力和生物量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 蔗糖濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶活力和生物量的影響

由圖2可見，隨著蔗糖濃度的增加，黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的活性和生物量均呈現(xiàn)先上升后緩慢降低趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度為12%時(shí)酶活力達(dá)到最大，為21.08 U/ml，此時(shí)黑曲霉YA03生物量也達(dá)到最大值,為20.98mg/ml。所以,試驗(yàn)確定蔗糖濃度為12%。

2.2.3 氮源對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶的影響

以12%蔗糖為碳源，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別用0.5%的不同氮源代替酵母膏作為唯一氮源，氮源對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的影響結(jié)果見表4。

表4 氮源種類對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶活力和生物量的影響

從表4可知，用酵母膏等有機(jī)氮源比硫酸銨等無(wú)機(jī)氮源更有利于微生物產(chǎn)酶，其原因是有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)成分比無(wú)機(jī)氮源豐富，更有利于微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成。牛肉膏為黑曲霉YA03產(chǎn)生β-呋喃果糖苷酶的最佳氮源，酶活最大值為32.81 U/ml，生物量為21.82mg/ml，而尿素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和β-呋喃果糖苷酶的活性具有明顯的抑制作用。所以，試驗(yàn)確定牛肉膏為最佳氮源。

2.2.4 氮源濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶的影響

以12%蔗糖為碳源、牛肉膏為氮源，改變培養(yǎng)基中的牛肉膏濃度，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液的酶活及生物量，牛肉膏濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶和生物量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 牛肉膏濃度對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶活力和生物量的影響

由圖3可以看出，牛肉膏濃度為0.6%時(shí)，黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活性最大，為33.19 U/ml；牛肉膏濃度為0.9%時(shí)，黑曲霉YA03生物量達(dá)到最大，為24.17mg/ml，但此時(shí)β-呋喃果糖苷酶活力較低。所以確定牛肉膏濃度為0.6%。

2.2.5 金屬離子對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶的影響

以12%蔗糖和0.6%牛肉膏為培養(yǎng)基的基本成分，在培養(yǎng)基中分別加入0.05%的不同金屬離子，以未加金屬離子的培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定金屬離子對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力和生物量的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同金屬離子對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)酶活力和生物量的影響

由表5 可知，K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Cu2+對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的活性均有抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最強(qiáng)烈；而 Mg2+、Fe2+、Mn2+對(duì)黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶有不同程度的促進(jìn)作用，以添加Mn2+酶活性最高，酶活為71.93 U/ml。

在單獨(dú)添加一種金屬離子的基礎(chǔ)上又做了同時(shí)添加金屬離子試驗(yàn)，即在培養(yǎng)基中同時(shí)添加0.05%的Mg2+、Fe2+、Mn2+3 種金屬離子，試驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力可達(dá)84.52 U/ml，比單一添加一種金屬離子的酶活力要高。所以，試驗(yàn)確定在培養(yǎng)基中同時(shí)添加 MnCl2·4H2O、MgSO4·7H2O 和FeSO4·7H2O，以提高黑曲霉YA03產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的能力。

2.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基[7]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以影響β-呋喃果糖苷酶活力較大的3個(gè)因素即蔗糖、牛肉膏、MnCl2·4H2O濃度為自變量，以β-呋喃果糖苷酶活力為響應(yīng)值，培養(yǎng)基中其它成分為 MgSO4·7H2O 0.05%和 FeSO4·7H2O 0.05%。根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平設(shè)計(jì)見表6，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表7 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 7.0軟件對(duì)表7數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，得到酶活力對(duì)實(shí)際自變量的多元二次回歸方程：

Y=－0.726 67＋9.412 33A＋114.880 56B＋178.533 33C－0.781 67AB＋1.290 00AC＋29.500 00BC－0.386 72A2－103.476 85B2－757.166 67C2，各因素的方差分析見表8。

回歸方程方差分析表明，該模型極顯著（P=0.002 6＜0.01），蔗糖、牛肉膏及其二次項(xiàng)對(duì)β-呋喃果糖苷酶活力影響極顯著(P＜0.01)，MnCl2·4H2O 對(duì) β-呋喃果糖苷酶活力有一定影響(P＜0.05)。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.970 5，校正系數(shù)R2Adj=0.917 4，且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合較好，因此可以用該回歸方程代替真試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

運(yùn)用Design Expert 7.0軟件繪制出三維響應(yīng)曲面圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖(見圖4～圖6)，并預(yù)測(cè)最佳蔗糖濃度為11.86%、牛肉膏濃度為0.53%、MnCl2·4H2O濃度為0.14%,最大β-呋喃果糖苷酶活力為97.90 U/ml。

表8 回歸模型的方差分析

圖4 蔗糖和牛肉膏對(duì)酶活力影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖（MnCl2·4H2O 0.14%）

圖5 蔗糖和MnCl2·4H2O對(duì)酶活力影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖（牛肉膏0.53%）

圖6 牛肉膏和MnCl2·4H2O對(duì)酶活力影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖（蔗糖11.86%）

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了證實(shí)響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)的結(jié)果，用以上得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果見表9。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表9可知，β-呋喃果糖苷酶活力的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值最大相差3.99%，且3次試驗(yàn)平均值與預(yù)測(cè)值接近，表明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值有較好的擬合性，進(jìn)一步證實(shí)了該模型的有效性。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)黑曲霉出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，紫外照射時(shí)間為2.5 min時(shí)，篩選得到一株高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力的突變株YA03，其產(chǎn)酶活力為3.75 U/ml，是出發(fā)菌株酶活的1.66倍；經(jīng)5次傳代培養(yǎng)，該突變株生長(zhǎng)旺盛、遺傳穩(wěn)定性良好。通過(guò)單因素和響應(yīng)面法確定該突變株產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的最佳培養(yǎng)基為蔗糖 11.86%、牛肉膏 0.53%、MnCl2·4H2O 0.14%、MgSO4·7H2O 0.05%和FeSO4·7H2O 0.05%。突變菌株YA03在此最優(yōu)培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶活力達(dá)96.58 U/ml，是優(yōu)化前產(chǎn)酶活力的25.7倍。

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