復(fù)方烏梅對鯉魚非特異性免疫的影響

向 楨 鄭曙明 楊進才 龔鴻霞 劉 英

（西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460）

近年來，中藥因其毒性低、無耐藥性和藥物殘留，以及廣泛的抗菌、抑菌作用等特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛的應(yīng)用。簡紀常等[1]研究發(fā)現(xiàn)，以黃芪為主的中草藥按1%比例添加到飼料中投喂建鯉15 d后，能明顯提高NBT（氮藍四唑）陽性細胞的數(shù)量，從而明顯提高建鯉的非特異性免疫能力。羅慶華[2]在鯉魚飼料中添加杜仲葉粉的試驗結(jié)果表明，杜仲葉粉能明顯提高鯉魚免疫應(yīng)答水平。胡兵等[3]發(fā)現(xiàn)飼料中添加不同水平的黃芪多糖對異育銀鯽的非特異性免疫力具有明顯的促進作用。劉麗平等[4]研究同樣得出，中草藥制劑能夠增強中華絨螯蟹抵抗疾病的能力。本試驗通過對鯉魚進行攻毒并且在攻毒前后投喂復(fù)方烏梅藥餌，進而探究復(fù)方烏梅對魚體非特異性免疫功能的影響以及防治疾病的效果，為中藥在提高魚機體免疫力方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

健康鯉魚400尾，體重為(48±1.31)g，購自重慶市榮昌縣梅石壩漁場。放養(yǎng)在水族箱里(100 cm×40 cm×50 cm)暫養(yǎng)一周，選擇體格健康、規(guī)格均勻的個體進行試驗。

1.2 藥餌制備

試驗飼料購自通威公司的鯉魚基礎(chǔ)飼料（其中蛋白質(zhì)含量為35%）。復(fù)方以烏梅為主藥,其他中藥為輔藥,經(jīng)烘干、粉碎后將各種中藥按一定比例混勻制成復(fù)方,再與通威鯉魚基礎(chǔ)飼料按照1%比例混勻后制成直徑為2.00 mm顆粒，45℃烘干、分裝、密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗菌株

溫和氣單胞菌（Aeromonas Sobria）由西南大學(xué)榮昌校區(qū)微生物教研室分離鑒定。將溫和氣單胞菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，選擇形狀規(guī)則、單一的菌落接種于液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，采用麥氏比濁法將菌液稀釋成濃度3×109cfu/ml的應(yīng)用菌液。

1.4 試驗設(shè)計

將試驗魚隨機分為5組：空白組（全程投喂基礎(chǔ)飼料、不攻毒）、對照組(全程飼喂基礎(chǔ)飼料并攻毒)、試驗Ⅰ組(攻毒前投喂基礎(chǔ)飼料、攻毒后投喂1%復(fù)方烏梅藥餌)、試驗Ⅱ組 (全程投喂1%復(fù)方烏梅藥餌并攻毒)、試驗Ⅲ組(攻毒前投喂1%復(fù)方烏梅藥餌、攻毒后投喂基礎(chǔ)飼料)。每組40尾，各設(shè)一個重復(fù)組。試驗期間各組按照試驗設(shè)計日投喂量為魚體重1.5%～2.0%的基礎(chǔ)飼料或藥餌,每天9:00和17:00兩次投喂，水溫(26±1)℃，24 h 充氣增氧，確保溶氧高于 6mg/l，每天換水2次，每次換水前用虹吸法吸出箱底的殘餌和糞便。試驗時間16 d，于試驗第9 d對試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組和對照組進行攻毒,每尾試驗魚胸鰭基部注射0.1 ml應(yīng)用菌液，空白組胸鰭基部注射0.9%的生理鹽水。觀察并記錄各組魚的癥狀及死亡數(shù)量，計算死亡率。

1.5 樣品采集

正式試驗開始后，每間隔3 d，分別從各組中隨機撈取3尾供試鯉魚，逐尾測量其體重后，對其尾靜脈抽血。以肝素抗凝，制備抗凝血，置4℃冰箱備用。以供紅細胞、血紅蛋白、NBT陽性細胞和淋巴細胞吞噬活性的測定。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 紅細胞數(shù)的測定

用紅細胞稀釋液(姬姆氏液)將非抗凝血進行200倍稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)紅細胞。計算公式為：

紅細胞數(shù)（106個/mm3）=計數(shù)板中的紅細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/計數(shù)室中格容積(稀釋倍數(shù)為200，計數(shù)室中格容積為0.02 mm3)。

1.6.2 血紅蛋白含量的測定

采用氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）法。在一試管中準確加入5.0 ml HiCN稀釋試劑，作為測定管。用血紅蛋白吸管準確吸取全血20 μl，置于試劑中，沖洗3次，混合?；旌弦悍胖? min后，倒入1 cm比色皿，于540 nm進行比色。以蒸餾水或HiCN稀釋試劑作為空白管，讀取測定管光密度值。

血紅蛋白含量（g/l）=OD×（64 458/44 000）×251=OD×367.7。

式中：OD——測定管光密度值；

64458——目前國際公認的血紅蛋白摩爾質(zhì)量；

44000——國際血液學(xué)標準化委員會公布的血紅蛋白摩爾吸光度；

251——稀釋倍數(shù)。

1.6.3 NBT陽性細胞的測定

根據(jù)修改后的 Anderson等[5]的方法，取 50 μl血細胞滴加于蓋玻片上，于室溫下的濕盒中溫育30 min后,在0.067 mol/l PBS（pH值6.4）中輕輕地洗滌蓋玻片以完全去除紅細胞，然后在載玻片上滴加50 μl 2mg/l NBT溶液，將蓋玻片反扣在NBT溶液上，于濕盒中溫育30 min，在顯微鏡下觀察。染成黑色或棕黑色的細胞為NBT陽性細胞。隨機選擇10個視野觀察結(jié)果，最后計算平均1個視野中NBT陽性細胞數(shù)。

1.6.4 淋巴細胞吞噬活性的測定

采用羅琳等[6]的方法取抗凝血，置小燒杯中，加入溫和氣單胞菌滅活菌苗輕輕攪動搖勻，37℃水浴中溫育30 min，每隔10 min搖動1次，而后1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用注射器吸取白細胞層細胞做血液涂片，風(fēng)干后，置于瑞氏染色缸上染色，瑞氏染色液浸染5～6 min后，用緩沖液浸染3～5 min，而后用蒸餾水洗干凈，涂片干燥后用油鏡檢測。根據(jù)下式計算淋巴細胞吞噬率（PP）及淋巴細胞吞噬指數(shù)（PI）。

吞噬率（%）=（100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數(shù)/100）×100；

吞噬指數(shù)(%)=（吞噬細胞內(nèi)的細菌總數(shù)/參與吞噬的吞噬細胞數(shù)）×100。

1.6.5 免疫器官指數(shù)的測定

每次采血后剖檢，觀察試驗魚內(nèi)臟器官的變化，分別將采血后的鯉魚肝胰臟、腎臟和脾臟分離，分離的臟器用4℃的生理鹽水沖洗干凈后用吸水紙吸干水分，稱重，并計算各免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（%）=免疫器官質(zhì)量（g）/魚體質(zhì)量（g）×100。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計處理軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan's法多重分析，顯著性水平為P＜0.05，極顯著水平為 P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 攻毒試驗結(jié)果

攻毒后，試驗魚在2 h后出現(xiàn)死亡，死亡集中在48～96 h?；疾◆~表現(xiàn)為游動緩慢，攝食降低或不食，鰭基部、上下頜等處有點狀充血，眼球充血突出，肛門充血，體表黏液增多，偶有鱗片脫落，腹部少許腫脹，解剖可見黃色或紅色腹水，肝臟、腎臟、心臟腫大。呈典型的細菌性敗血癥癥狀，表明患病魚體因細菌性敗血癥致死。

攻毒死亡率結(jié)果見表1，3個試驗組的死亡率均顯著低于對照組（P＜0.05），其中，攻毒后投喂藥餌的試驗Ⅰ組和全程投喂藥餌的試驗Ⅱ組死亡率，極顯著低于對照組，說明全程給藥組能顯著降低患病鯉魚的死亡率，提高其抗病存活率。

表1 攻毒后鯉魚的死亡率

2.2 紅細胞含量測定結(jié)果（見圖1）

圖1 紅細胞含量的變化

全程投喂藥餌的試驗Ⅱ組和攻毒前投喂藥餌的試驗Ⅲ組在攻毒前紅細胞數(shù)不斷增加，試驗7 d時兩試驗組紅細胞數(shù)約2.5×106個/mm3，顯著高于對照組1.6×106個/mm3（P＜0.05）；攻毒后，投喂基礎(chǔ)飼料的試驗Ⅲ組紅細胞數(shù)呈下降趨勢，而投喂藥餌的試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組紅細胞數(shù)持續(xù)增加，試驗結(jié)束16 d時試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組紅細胞數(shù)雖略有減少，但攻毒后期兩試驗組紅細胞數(shù)約 2.2×106～2.9×106個/mm3，相對于對照組 1.6×106個/mm3，差異極顯著（P＜0.01）。說明復(fù)方烏梅能顯著增加鯉魚的紅細胞數(shù)，而全程給藥組（試驗Ⅱ組）效果最佳。

2.3 血紅蛋白含量測定結(jié)果（見圖2）

圖2 血紅蛋白含量的變化

攻毒前后，3個試驗組血紅蛋白含量的變化趨勢不明顯,與對照組相比血紅蛋白含量差異不顯著 (P＞0.05),說明復(fù)方烏梅對魚體血紅蛋白含量的變化影響不大。

2.4 NBT陽性細胞數(shù)測定結(jié)果（見圖3）

攻毒前，各試驗組NBT陽性細胞數(shù)與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；攻毒后，全程投喂藥餌的試驗Ⅱ組NBT陽性細胞數(shù)持續(xù)增加，且在試驗結(jié)束16 d時，其NBT陽性細胞數(shù)增加到最大值，顯著高于試驗Ⅰ組、試驗Ⅲ組和對照組（P＜0.05）。說明持續(xù)投喂復(fù)方烏梅能明顯增加鯉魚NBT陽性細胞數(shù)。

2.5 淋巴細胞吞噬活性測定結(jié)果

淋巴細胞吞噬率和吞噬指數(shù)趨勢見圖4、圖5。整個試驗階段，3個試驗組淋巴細胞吞噬率和吞噬指數(shù)總體呈上升趨勢，并在試驗7 d以后，試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組淋巴細胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05），而試驗Ⅱ組極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明復(fù)方烏梅能顯著提高鯉魚淋巴細胞的吞噬活性，尤以全程給藥組（試驗Ⅱ組）效果最佳。

圖3 鯉魚NBT陽性細胞數(shù)的變化

圖4 淋巴細胞吞噬率的變化

圖5 淋巴細胞吞噬指數(shù)的比較

2.6 免疫器官指數(shù)測定結(jié)果

各免疫器官指數(shù)的變化見圖6、圖7、圖8。結(jié)果顯示，整個試驗階段，各試驗組肝胰臟指數(shù)呈現(xiàn)不同程度的上升，在試驗結(jié)束16 d時各試驗組肝胰臟指數(shù)與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。而試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)在整個試驗過程中均呈上升趨勢，試驗結(jié)束16 d時試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組的腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），說明復(fù)方烏梅對鯉魚免疫器官的影響不明顯。

圖6 肝胰臟指數(shù)的變化

圖7 腎臟指數(shù)的變化

圖8 脾臟指數(shù)的變化

3 討論

3.1 中藥對紅細胞及血紅蛋白含量的影響

Siegel等[7]在1981年提出紅細胞免疫系統(tǒng)（Redcell immune system）的新概念，認為紅細胞的數(shù)量直接或間接影響著機體的免疫能力，也可以間接的反應(yīng)出此種藥物對疾病的預(yù)防和治療能力。本試驗結(jié)果顯示，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在投喂藥餌時期，紅細胞數(shù)均顯著高于對照組，說明復(fù)方烏梅能迅速被魚體吸收并達到藥效積累，促進魚體增加自身紅細胞數(shù)，從而提高機體的免疫能力。廖立坤[8]曾以復(fù)方烏梅口灌鯽魚后，發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)血液藥效濃度能夠迅速達到峰值，也證明復(fù)方烏梅能被鯽魚腸道迅速吸收，并達到抑菌作用，因為復(fù)方烏梅是以有機酸類、黃酮為主要有效成分的復(fù)方。已有許多報道[9-10]證明，有機酸類（Organic acids）具有較強的抑菌作用。而攻毒后，投喂基礎(chǔ)飼料的試驗Ⅲ組紅細胞數(shù)不斷減少，分析原因可能是體內(nèi)藥效不斷減少所致；而投喂復(fù)方烏梅藥餌的試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組紅細胞數(shù)雖繼續(xù)增加，但在試驗13 d后表現(xiàn)為減少趨勢，原因可能是復(fù)方烏梅的最佳藥效是給藥2周內(nèi)，或者與機體免疫疲勞有關(guān)[11]。整個試驗階段，各試驗組血紅蛋白含量與對照組相比差異不顯著；但在試驗結(jié)束16 d，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組血紅蛋白數(shù)高于對照組，說明復(fù)方烏梅對魚體血紅蛋白的增加有一定的作用，只是沒有紅細胞增加明顯，但與韓兆紅等[12]研究中草藥提取物對團頭魴生長及免疫力的影響結(jié)果一致。

3.2 中藥對NBT陽性細胞數(shù)的影響

在魚類血細胞中，吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞都具有吞噬異物的能力，是魚類非特異性免疫的主要指標之一，它們的數(shù)量和吞噬能力的高低可直接反映出魚類非特異性免疫能力的大小，在魚類的非特異性免疫中起著至關(guān)重要的作用。NBT陽性細胞就是這3種細胞的總稱。這些細胞吞噬了NBT（氮藍四唑）后，胞質(zhì)中的葡萄糖-6-磷酸氧化所脫下的氫被NBT接受，使淡黃色的NBT還原成棕黑色，因而，NBT是研究這3種細胞數(shù)量和吞噬能力的極好指示劑。國內(nèi)外不少學(xué)者通過研究NBT陽性細胞數(shù)來研究機體非特異性免疫力。如Jian（2003）[13]按5：1的比例將黃芪、當(dāng)歸添加到飼料中投喂大黃魚，結(jié)果在投喂后第20、25、30 d，添加量為1%和1.5%的試驗魚NBT陽性細胞數(shù)量都顯著高于對照組。說明中草藥能夠增強大黃魚非特異性免疫力。

本次試驗結(jié)果表明，投喂藥餌的試驗組NBT陽性細胞數(shù)在攻毒前變化幅度不大，但含量高于對照組，與陳玉春[14]用復(fù)方中草藥投喂鏡鯉14 d后，其復(fù)方組與對照組差異不顯著，但復(fù)方組NBT陽性細胞數(shù)均高于對照組的研究結(jié)果一致，說明復(fù)方烏梅已經(jīng)開始對試驗魚的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用，只是藥物在體內(nèi)還未達到最大效能；而攻毒后，投喂藥餌組的NBT陽性細胞數(shù)持續(xù)增加，且全程給藥組（試驗Ⅱ組）在試驗結(jié)束16 d，其NBT陽性細胞數(shù)顯著高于試驗Ⅰ組、試驗Ⅲ組和對照組，說明持續(xù)投喂復(fù)方烏梅藥餌，其藥效作用達到了積累，能明顯促進魚體NBT陽性細胞數(shù)的增加，這一規(guī)律與劉華忠等[15]研究添加1%復(fù)方中藥到飼料中進行投喂彭澤鯽，14 d后NBT陽性細胞數(shù)顯著高于對照組的研究結(jié)果一致。表明中藥能夠顯著增加鯉魚非特異性免疫細胞的數(shù)量，起到增強魚體非特異性免疫功能的作用。

3.3 中藥對淋巴細胞吞噬活性的影響

淋巴細胞是來源于淋巴樣系列在免疫應(yīng)答過程中起核心作用的白細胞，白細胞具有強大的吞噬功能，是機體非特異性免疫的重要部分。一般認為，動物體內(nèi)的吞噬細胞可吞噬進入體內(nèi)的異物，吞噬細胞在消化病原生物的同時，可保留有關(guān)的抗原信息并將其傳遞給有關(guān)的淋巴細胞，從而激發(fā)機體的細胞免疫和體液免疫。因此，吞噬細胞的吞噬活性直接與動物的免疫機能有關(guān)。蔡中華等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大黃、黃連、花粉能引起鯉魚吞噬細胞吞噬能力的增強，能顯著提高魚體非特異性免疫能力；劉金海等[17]通過對半滑舌鰨投喂添加中藥的免疫餌料，30 d時白細胞吞噬活性增強，且與對照組相比差異顯著；吳凡[18]在免疫刺激劑對水產(chǎn)動物免疫機能影響的研究中，發(fā)現(xiàn)4個投喂甘草素的試驗組其異育銀鯽白細胞的吞噬活性均顯著增強，說明中藥對魚體非特異性免疫有促進作用。

本次試驗結(jié)果表明，3個試驗組的淋巴細胞吞噬活性總體呈上升趨勢，并且在試驗結(jié)束16 d，3個試驗組的淋巴細胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著高于對照組和空白組，與上述類似研究結(jié)果符合。而在試驗結(jié)束16 d，3個試驗組的淋巴細胞吞噬活性變化趨于平緩，說明鯉魚的最佳免疫時間段可能是在給藥前2周，隨著投喂藥餌時間的延長，免疫指標保持在一個相對穩(wěn)定的水平。但總的來說，試驗組的免疫指標明顯高于對照組，說明復(fù)方烏梅能顯著提高鯉魚淋巴細胞的吞噬活性，增強魚體的非特異性免疫，而持續(xù)投喂藥餌的免疫效果最佳。

3.4 中藥對免疫器官指數(shù)的影響

脾臟、腎臟和肝胰臟是魚的主要免疫器官。脾臟是機體內(nèi)最大的外周免疫器官，是產(chǎn)生致敏淋巴細胞和抗體的場所之一[19]；腎臟是魚類重要的淋巴細胞組織。而魚類的肝胰臟是重要的解毒器官，具有防御免疫能力[20]；理論上免疫器官重量的變化與機體免疫狀況的變化密切相關(guān)。在一定程度上，免疫器官內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量能夠從免疫器官的重量得到體現(xiàn)，從而間接了解體內(nèi)淋巴細胞總體水平。盧彤巖等[21]在餌料中添加1%的黃芪、板藍根投喂鯉魚45 d后，結(jié)果均可以明顯提高魚體免疫器官（胸腺、頭腎和脾臟）的重量。王海華等[22]擬用3個復(fù)方中藥方劑研究彭澤鯽的免疫系統(tǒng)，結(jié)果復(fù)方中藥能顯著增大魚體的頭腎指數(shù)和脾臟指數(shù)。但也有不同的研究結(jié)果：顧雪飛等[23]在配合飼料中添加刺五加、蒲公英等單方中草藥飼喂鯉魚，在試驗第15 d與30 d后，所有試驗組的各免疫器官指數(shù)與對照組相比均無顯著性差異；胡兵等[3]研究飼料中添加不同水平的黃芪多糖對異育銀鯽非特異性免疫力的影響，結(jié)果第15、30和45 d時，各試驗組頭腎指數(shù)差異不顯著；而脾臟指數(shù)雖有一定變化，但與空白對照組比較無顯著差異。

本次研究結(jié)果表明，試驗魚各免疫器官指數(shù)與對照組相比均無顯著差異，說明此復(fù)方對鯉魚免疫器官的增重影響不明顯，分析原因可能是此復(fù)方對鯉魚免疫器官的影響存在一定的“時效”關(guān)系，中藥藥效還沒有積累達到一定程度，具體原因則有待于進一步研究。

4 結(jié)論

飼料中添加復(fù)方烏梅可顯著提高鯉魚攻毒后的存活率；飼料中添加復(fù)方烏梅可顯著增加鯉魚紅細胞數(shù)和NBT陽性細胞數(shù)，以及提高鯉魚淋巴細胞的吞噬活性；飼料中添加復(fù)方烏梅對鯉魚血紅蛋白含量及免疫器官指數(shù)的變化影響不大。

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