低氧環(huán)境下肺腺癌A549細胞自噬及m iR-155表達變化的研究

徐麗瑤，李 勇，鐘小軍，符碧琪，李麗芳，蔡阿橋

（南昌大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌330006）

細胞自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，它對維持細胞生長、分化及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞可通過自噬緩解代謝壓力，克服營養(yǎng)缺乏和低氧環(huán)境得以生存。低氧時肺腺癌A549細胞自噬活性增強，但其具體調控機制尚未明確。microRNA作為一種轉錄后調節(jié)機制，在多個生物學過程中發(fā)揮作用。新近研究表明：microRNA可通過沉默自噬信號通路上的關鍵蛋白，參與自噬多個環(huán)節(jié)的調控[1]，但microRNA可否作用于低氧誘導A549細胞自噬過程尚未見報道。本研究通過觀察體外常氧和低氧培養(yǎng)環(huán)境下人肺腺癌A549細胞miR-155，自噬標記蛋白LC3及自噬體變化，為探討miR-155與自噬關系的研究打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細胞 （中國科學院上海細胞庫）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白提取試劑盒（美國Pierce公司）；PCR儀（美國 ABI公司）；引物（大連 Takara 公司）；Trizol、SYBR-GREEN Real-Time試劑盒（美國Invitrogen公司）；三氣培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；蛋白電泳儀、電轉儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人肺腺癌A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2/95%空氣（常氧）飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的A549細胞經0.25%胰酶消化后，根據(jù)后續(xù)實驗的不同，分別接種于60 mm培養(yǎng)皿、6孔板及96孔板中培養(yǎng)12 h。更換新鮮培養(yǎng)基后置于37℃，1%O2/5%CO2/94%N2三氣培養(yǎng)箱中，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組

分別在常氧（20%O2/5%CO2/75%N2）（常氧組）及低氧 （1%O2/5%CO2/94%N2）（低氧組）環(huán)境下培養(yǎng)A549細胞。

1.3 自噬體水平測定

取接種于60mm培養(yǎng)皿中的A549細胞，分別于0、24、48 h用不含EDTA的胰酶消化細胞，PBS洗3次，加入新配的4%多聚甲醛，4℃過夜。然后將細胞沉淀放入1%的四氧化鋨中，室溫固定1 h，經一系列脫水及包埋后，固定于銅網上用電鏡觀察。

1.4 LC3蛋白水平測定

取接種于6孔板中的A549細胞，于0、24、48 h后收集細胞，冷PBS洗2次，加入細胞裂解液于4℃裂解 20 min，12 000 r·min-1離心 20 min，收集上清，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取20μg樣品煮沸變形后進行Tricine-SDS-PAGE電泳、轉膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜；二抗37℃孵育1 h，ECL法顯影；分析條帶灰度值，以目的條帶與β-Actin調對灰度比值來表示蛋白相對表達量。

1.5 m iR-155水平測定

取接種于6孔板中的A549細胞，于0、24、48 h后收集細胞，按照TRIzol試劑 (Invitrogen，CA，USA)說明書，常規(guī)方法抽提總RNA。依照說明書操作ABI 7500 Fast Real-Time PCR System。反轉錄條件：總 RNA100 ng·20 μL-1反應液。 16 ℃ 20min，30 ℃30 s60個循環(huán)，42℃30 s，50℃1 s。 70℃孵育 15min。PCR 條件：RT產物 1μL，miR-X 1μL，引物 1μL，10×SYBR Green I 0.5 μL。95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60℃ 60 s。MiRNA的相對表達量用2-△△ct的方法來進行比較。U6作為內參。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 低氧對A549細胞自噬標記蛋白LC3蛋白表達的影響

LC3分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當自噬形成時，LC3Ⅰ轉變?yōu)長C3Ⅱ。與常氧組相比，低氧組LC3II表達水平上調，LC3Ⅰ表達水平下調，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（0.46±0.03）倍（圖 1）。

圖1 常氧或低氧條件下A549細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化

2.2 A549細胞m iR-155表達水平的變化

相較常氧組，低氧組miR-155表達上調，于24、48 h 分別增加（1.45±0.23）倍及（2.10±0.32）倍（圖2）。

圖2 常氧或低氧環(huán)境下A549細胞miR-155表達變化

3 討論

自噬是指細胞在饑餓、能量代謝缺乏等應激狀態(tài)下的一種“自我吞食”過程[2]。肺癌等實體腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，由于腫瘤細胞的快速增殖和血管新生的相對滯后，腫瘤內部常處于低氧狀態(tài)。低氧可誘導細胞自噬的發(fā)生，本實驗結果也證實，低氧培養(yǎng)時，A549細胞自噬體數(shù)量及LC3II表達較常氧培養(yǎng)時明顯增高。

自噬作為一種防御機制，在應激狀態(tài)下特別是缺氧條件下對維持腫瘤細胞存活具有積極作用。這種作用是通過一些腫瘤相關信號轉導通路完成的，其中包括哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）依賴的信號轉導通路、Beclin1網絡系統(tǒng)、LKB1-AMPK信號轉導通路及p53相關自噬信號轉導通路等[3]，而細胞自噬的調控則是一個動態(tài)的、涉及多分子的復雜過程，其具體機制目前尚未得到完全闡明。

MicroRNA（miRNAs）是一類長約 22 nt大小的非編碼RNA分子，通過影響靶mRNA的穩(wěn)定性和（或）翻譯效率對基因表達起負性調控作用。MicroRNA作為一種轉錄后調節(jié)機制，廣泛參與自噬多個環(huán)節(jié)的調控。 L.B.Frankel等[2]研究發(fā)現(xiàn)，miR-101 通過靶向STMN1、RAB5A和ATG4D抑制 MCF-7細胞自噬發(fā)生。而miR-30則通過下調Beclin1的表達下調T98G 細胞自噬水平[3]。

N.Yanaihara 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中 miR-155高表達與預后不良相關，但其具體機制未明。miR-155可否通過調控肺癌自噬水平從而影響預后引起大家的關注。U.Bruning等[5]證實 miR-155可負性調控低氧誘導因子HIF-1α表達。實體腫瘤處于低氧微環(huán)境中，低氧誘導因子HIF-1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha）可大量表達，其活性顯著增強[6]。 HIF-1α 可上調 bcl-2/腺病毒 E1B19kD 相互作用蛋白 BNIP3表達[7]，BNIP3則通過干擾 Beclin-1與bcl-2及bcl-XL之間的相互作用而誘導自噬的發(fā)生[8]。因此，本實驗選取肺腺癌A549細胞作為研究對象，觀察不同氧濃度細胞自噬水平及miR-155表達量變化，結果發(fā)現(xiàn)，低氧可成功誘導A549細胞自噬發(fā)生，同時觀察到在自噬被誘發(fā)同時，miR-155水平明顯增高。故筆者推測miR-155可能通過作用于自噬信號通路的相關分子影響低氧環(huán)境中A549細胞自噬水平。因本研究觀察時間點過少，有必要增加時間點，以進一步發(fā)現(xiàn)miR-155與自噬改變的相關性。明確miR-155與自噬的關系，以及miR-155調控低氧介導的A549細胞自噬途徑的相關靶點及具體機制是下一步研究的重點。

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