膠原/羥基磷灰石一體化支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的機(jī)制研究

劉興漠，項禹誠，潘滔，孫青，王德春，王迎軍，吳剛

目前已有大量實驗研究利用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，各種新型修復(fù)材料層出不窮，但在臨床上仍不能利用此技術(shù)高質(zhì)量地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損并達(dá)到很好的遠(yuǎn)期療效[1-2]。這在很大程度上是因為具體的修復(fù)機(jī)制以及相應(yīng)的理論尚不明確。在前期研究工作中，我們已證實膠原/羥基磷灰石骨一體化修復(fù)體具有良好的生物相容性，并且在動物體內(nèi)誘導(dǎo)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)[3]。本研究觀察其在實驗性兔膝骨關(guān)節(jié)全層軟骨缺損修復(fù)中對基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)活化和表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材 6～8周齡新西蘭白兔45只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。實驗過程中動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。新型膠原/羥基磷灰石骨一體化修復(fù)體由華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供，為“雙極”結(jié)構(gòu)，體外實驗證實材料完全降解時間為16周，環(huán)氧乙烷消毒備用。免疫組織化學(xué)試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒：上海飛捷生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物造模 實驗動物隨機(jī)分為3組，各15只。正常組不予處理，實驗組與對照組分別用10%戊巴比妥鈉10 mg/kg耳緣靜脈麻醉，隨機(jī)逐層切開一側(cè)膝部皮膚至關(guān)節(jié)囊，將髕骨推向外側(cè)，暴露關(guān)節(jié)腔，于股骨內(nèi)外髁間制備全層軟骨缺損，直徑3.5 mm，深6 mm達(dá)髓腔，鉆頭配保護(hù)圈，防止鉆孔過深；實驗組植入大小、形狀與缺損相似的新型膠原/羥基磷灰石骨一體化修復(fù)體，對照組不予修復(fù)體植入。髕骨回位，仔細(xì)止血，逐層閉合關(guān)節(jié)囊和皮膚。術(shù)后所有動物均肌注青霉素5×105U。膝關(guān)節(jié)不固定，置籠內(nèi)自由活動。

1.3 RT-PCR檢測 術(shù)后24 h、48 h、1周、2周和4周隨機(jī)選取各組實驗動物3只，按照1.2方法麻醉后切開術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)(正常組隨機(jī)一側(cè))，切除部分滑膜組織后逐層縫合切口并將動物放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。將取下的滑膜組織行ELISA測定MMPs mRNA的表達(dá)水平。按照試劑盒操作說明提取滑膜組織總RNA，紫外分光光度法(260/280 nm)測定MMPs RNA含量及純度，-80℃儲存?zhèn)溆?。按照常?guī)方法進(jìn)RT-PCR實驗。退火溫度58℃，共32個循環(huán)。RT-PCR引物設(shè)計見表1。擴(kuò)增完畢后8μl產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，紫外攝像。以目的基因與內(nèi)參基因條帶的積分吸光度比值表示4個基因的表達(dá)水平。同一實驗重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物設(shè)計

1.4 大體觀察 術(shù)后1、2、4周分別靜脈注射利多卡因處死每組動物各5只，取膝關(guān)節(jié)軟骨，肉眼觀察，采用Wakitani等改良的半定量組織學(xué)評分法[4]進(jìn)行評分。

1.4.1 細(xì)胞形態(tài) 無透明軟骨細(xì)胞：0分；透明軟骨細(xì)胞為主：1分；纖維軟骨細(xì)胞為主：2分；非軟骨細(xì)胞為主：3分；全部非軟骨細(xì)胞：4分。

1.4.2 基質(zhì)染色 正染色：0分；輕度減弱：1分；明顯減弱：2分；未著色：3分。

1.4.3 表面平整度 表面光滑：0分；表面較光滑：1分；表面不規(guī)則：2分；表面極不規(guī)則：3分。

1.4.4 新生軟骨厚度 ≥正常2/3：0分；達(dá)正常軟骨1/3～2/3：1分；＜正常軟骨1/3：2分。

1.4.5 與周圍正常軟骨組織整合 兩邊結(jié)合：0分；一邊結(jié)合：1分；不結(jié)合：2分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以(±s)表示，分別對各組檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后實驗動物雙膝活動少，至1周時活動增加，行走正常，手術(shù)切口愈合良好，均無感染。術(shù)后2周實驗組缺損區(qū)由新生乳白色組織填充，表面平整，有光澤，與周圍正常軟骨界線模糊(圖1a)，而對照組缺損區(qū)無明顯修復(fù)(圖1b)；術(shù)后4周實驗組缺損區(qū)外觀與周圍正常軟骨組織相似，不易辨別，切面可見修復(fù)組織與周圍結(jié)合緊密(圖1c)，對照組缺損區(qū)由白色纖維組織填充，表面粗糙，與周邊正常組織界線明顯，切面可見修復(fù)組織不完全填充缺損區(qū)(圖1d)。各時間點兩組間Wakitani半定量組織學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 術(shù)后不同時間點修復(fù)組織Wakitani半定量組織學(xué)評分

2.2 關(guān)節(jié)滑膜MMPs mRNA表達(dá) 3組關(guān)節(jié)中術(shù)前、術(shù)后均有MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)。正常組4種MMPs絕對表達(dá)值極低，相對表達(dá)值維持恒定；實驗組和對照組4種MMPs的表達(dá)水平在術(shù)后24 h達(dá)到峰值，并在4周內(nèi)逐步下降。其中術(shù)后1周實驗組和正常組MMP-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后48 h實驗組和正常組MMP-3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后1周實驗組和正常組MMP-9表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)前和術(shù)后4周實驗組MMP-13表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后4周實驗組和對照組MMP-2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 不同時間點各組MMPs表達(dá)(n=3)

圖1 術(shù)后不同時間點關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)結(jié)果

3 討論

顏煒群等在國內(nèi)首次將軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)成軟骨組織，推出了軟骨組織工程新技術(shù)[5]。目前各種治療軟骨缺損的支架材料各有優(yōu)缺點，但尚無完全理想的軟骨組織工程支架材料，這是因為天然材料支架存在一定的免疫原性，與細(xì)胞復(fù)合后存在易發(fā)生收縮和碎裂、力學(xué)強(qiáng)度較差等不足和缺陷[6]；另外，作為軟骨細(xì)胞賴以生存的三維空間，理想的生物支架材料不僅必須具有良好的生物相容性，同時還必須為種子細(xì)胞提供合適的黏附、分化、增殖微環(huán)境。直接移植成熟軟骨，其退行性變發(fā)生較早且嚴(yán)重[7]。

本實驗采用的支架材料為“雙極”結(jié)構(gòu)，包括適于軟骨細(xì)胞生長的修復(fù)體上層以及適合骨細(xì)胞生長的修復(fù)體下層。上層結(jié)構(gòu)主體由經(jīng)過改性的生物大分子組成，并復(fù)合具有緩釋作用的促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長的生長因子釋放微球及其他生物活性成分；下層結(jié)構(gòu)主體以高生物活性的納米鈣磷鹽組成，同時復(fù)合相關(guān)的生長因子釋放微球、部分天然大分子及其他生物活性成分。我們的前期研究已證實所采用的一體化修復(fù)材料無毒、無刺激性，具有良好的生物安全性，并能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨和與之相聯(lián)系的軟骨下骨協(xié)同修復(fù)[3]。楊波等利用掃描電鏡觀察支架材料的超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，新型膠原/羥基磷灰石骨支架材料的骨層和軟骨層之間沒有明顯的物理界面，能確保植入體內(nèi)后支架與軟骨下骨組織快速結(jié)合及固定，提供軟骨再生所需要的生理及力學(xué)環(huán)境[8]。

MMPs已知有26種，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)和作用底物的特異性可以分為5個亞型，其中MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的水解底物均為纖維類膠原，并且是MMPs級聯(lián)激活途徑中的關(guān)鍵MMPs[9]。

正常關(guān)節(jié)中MMPs與金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的表達(dá)量極低，由于各種理化因素的影響，MMPs與TIMPs之間的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度降解。大量研究證實，MMPs的過度表達(dá)可導(dǎo)致軟骨逐漸出現(xiàn)炎癥、潰瘍、缺損等一系列退行性變[10]。這提示我們，抑制MMPs的活化和表達(dá)可以延緩關(guān)節(jié)軟骨退行性變的過程，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供良好的細(xì)胞生長微環(huán)境。

本實驗表明，3組關(guān)節(jié)中術(shù)前、術(shù)后均有MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)，但是各時間點正常組4種MMPs在關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中的絕對表達(dá)值幾乎檢測不到，其相對表達(dá)值(與GADPH比值)維持恒定。而在實驗組和對照組的4種MMPs的表達(dá)水平在術(shù)后24 h即達(dá)到峰值，并在4周內(nèi)逐步下降。其中實驗組MMP-2、MMP-3和MMP-9分別在術(shù)后1周、術(shù)后48 h和術(shù)后1周的表達(dá)水平與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，這說明關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)過程中，修復(fù)材料對各種MMPs亞型的活化和表達(dá)水平均有調(diào)節(jié)作用。

實驗組MMP-13的表達(dá)水平在術(shù)前和術(shù)后4周有顯著性差異(F=1.73,P=0.0059,n=3)，這可能與MMP-13關(guān)節(jié)軟骨的缺損和修復(fù)的病理生理過程中持續(xù)表達(dá)有關(guān)[9]。有研究表明，MMP-13不僅可以直接降解軟骨基質(zhì)中的纖維類膠原，而且其他MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解也需要通過MMP-13起作用[10]。

綜上所述，新型膠原/羥基磷灰石一體化修復(fù)體能在軟骨缺損修復(fù)過程中有效的抑制炎癥因子的活化表達(dá)，減少ECM的破壞和降解，為軟骨修復(fù)提供良好的細(xì)胞增殖分化環(huán)境。一體化修復(fù)體對MMPs以及其他細(xì)胞因子的具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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