康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦梗死大鼠認(rèn)知功能、海馬內(nèi)突觸素和神經(jīng)顆粒素表達(dá)的影響

李雨峰，吳瑩，程明，徐麗，黃林，李怡，余茜

腦梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，幸存者中約70%～80%有不同程度的后遺癥，40%不能生活自理。這些存活的患者常遺留癱瘓、失語(yǔ)等嚴(yán)重殘疾并有相應(yīng)的認(rèn)知障礙，其中以學(xué)習(xí)記憶障礙最為常見(jiàn)、持久。如何促進(jìn)腦梗死后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)成為現(xiàn)代康復(fù)治療研究的重點(diǎn)。

大量研究提示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能通過(guò)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)再生、修復(fù)和突觸的可塑性而改善機(jī)體的功能。突觸素(synaptophysin,Syn)為突觸前膜標(biāo)志蛋白，是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能極為相關(guān)的糖蛋白，幾乎所有中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的突觸前終末內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有突觸素[1]。神經(jīng)顆粒素(neurogranin,Ng)是一種新發(fā)現(xiàn)的腦特異性突觸后蛋白，主要在大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體和杏仁核中高表達(dá)，可能在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(突觸可塑性)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-5]。本研究采用線栓法制成大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血梗死模型，并對(duì)康復(fù)組大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察突觸前膜標(biāo)志蛋白突觸素及突觸后蛋白神經(jīng)顆粒素的表達(dá)變化，并進(jìn)行神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定，探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)腦梗死大鼠認(rèn)知功能影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠75只，體重(250±50)g，8周齡，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

1.2 試劑和儀器 試劑：多聚甲醛；戊巴比妥鈉；Syn免疫組織化學(xué)試劑盒；Ng免疫組織化學(xué)試劑盒；多聚賴氨酸；DAB顯色試劑盒(棕色)等。儀器：Ax70熒光顯微鏡；DP-70圖像分析系統(tǒng)；Y-型迷宮；85-2型磁力攪拌器等以及自制滾筒網(wǎng)狀訓(xùn)練儀、平衡訓(xùn)練棒、轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練儀、網(wǎng)屏訓(xùn)練儀。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 參照小泉線栓法[6]制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血梗死模型。手術(shù)后2 h符合以下4項(xiàng)體征即模型成功：①動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；②同側(cè)Hornor氏征；③爬行時(shí)向左劃圈；④站立時(shí)左側(cè)傾倒。

將造模成功的48只動(dòng)物隨機(jī)分為腦梗死自由活動(dòng)組(模型組，n=24)和腦梗死運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(康復(fù)組，n=24)，每組又分為術(shù)后15 d、25 d、35 d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組各8只。各組大鼠都處于相同的環(huán)境喂養(yǎng)中。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 康復(fù)組大鼠在手術(shù)后第5天開(kāi)始進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，采用以下裝置：滾筒網(wǎng)狀式訓(xùn)練儀：訓(xùn)練大鼠抓握、旋轉(zhuǎn)及行走能力；平衡訓(xùn)練：訓(xùn)練其平衡能力；網(wǎng)屏訓(xùn)練：訓(xùn)練大鼠的抓握能力及肌力；轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練：訓(xùn)練其動(dòng)態(tài)平衡。40 min/d，6d/周。

1.3.3 神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 兩組分別于術(shù)后15d、25d、35d進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定和運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分。

神經(jīng)功能評(píng)分采用Bederson等[7]的評(píng)定方法：0級(jí)：未有神經(jīng)缺失癥狀；1級(jí)：將大鼠尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；2級(jí)：除1級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；3級(jí)：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。

平衡木行走測(cè)評(píng)：0分：能跳上平衡木，在上面行走不會(huì)跌到；1分：能跳上平衡木，在上面跌到的機(jī)會(huì)少于50%；2分：能跳上平衡木，跌倒的機(jī)會(huì)大于50%；3分：在健側(cè)后肢幫助下能跳上平衡木，但癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動(dòng)；4分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；5分：將鼠放在平衡木上會(huì)掉下來(lái)。

網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)：0分：前爪握住網(wǎng)屏大約5s不會(huì)掉下來(lái)；1分：暫時(shí)握住網(wǎng)屏，需滑落一段距離，但沒(méi)有掉下來(lái)；2分：在5s內(nèi)掉下來(lái)；3分：網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，鼠即刻掉下來(lái)。

轉(zhuǎn)棒行走測(cè)評(píng)：0分：轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，鼠可在棒上面行走；1分：在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，鼠不會(huì)掉下來(lái)，時(shí)間60s以上；2分：轉(zhuǎn)動(dòng)開(kāi)始后鼠從棒上掉下來(lái)；3分：轉(zhuǎn)動(dòng)開(kāi)始前，鼠就從棒上掉下來(lái)。

1.3.4 學(xué)習(xí)記憶能力 術(shù)后35 d對(duì)相應(yīng)亞組大鼠進(jìn)行Y-型迷宮[8]測(cè)試：實(shí)驗(yàn)前，將大鼠放入迷宮，使其適應(yīng)5 min，然后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯(cuò)誤，跑到暗臂記為正確。每天訓(xùn)練30 min，連續(xù)刺激10次后大鼠休息2 min，記錄大鼠學(xué)會(huì)(連續(xù)10次訓(xùn)練中有9次正確即學(xué)會(huì))所需的訓(xùn)練次數(shù)，訓(xùn)練次數(shù)越少表明大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.3.5 取材及免疫組化 所有大鼠在康復(fù)訓(xùn)練后各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分后分別取材，每個(gè)亞組取材8只。在視交叉前2 mm至視交叉后2 mm范圍內(nèi)(含海馬的腦段)冠狀取材，經(jīng)脫水—透明—浸蠟—包埋。進(jìn)行Syn及Ng免疫組織化學(xué)染色。用DP-70圖像采集系統(tǒng)采集圖片，Image-pro Plus 5.1軟件進(jìn)行半定量分析。每張切片隨機(jī)取上下左右中5個(gè)視野，分別測(cè)定Syn陽(yáng)性產(chǎn)物信號(hào)的面積和Ng陽(yáng)性產(chǎn)物信號(hào)的面積占當(dāng)時(shí)視野面積的百分比，測(cè)定其陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度(OD)值，并減去背景光密度值，得到校正光密度值。

2 結(jié)果

在造模程中，模型不成功或死亡27只，分組后，模型組2只、康復(fù)組3只大鼠死亡，均進(jìn)行及時(shí)隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組大鼠數(shù)量不變。

2.1 神經(jīng)功能與運(yùn)動(dòng)功能 康復(fù)組神經(jīng)功能、平衡木行走、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒行走術(shù)后15 d與同期模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，術(shù)后25 d、35 d均低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表1～表4。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能測(cè)評(píng)比較

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)平衡木行走測(cè)評(píng)比較

表3 兩組各時(shí)間點(diǎn)網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)比較

表4 兩組各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒行走測(cè)評(píng)比較

神經(jīng)功能評(píng)分與轉(zhuǎn)棒評(píng)分(r=0.574,P＜0.01)、平衡木評(píng)測(cè)(r=0.685,P＜0.01)、網(wǎng)屏評(píng)測(cè)(r=0.703,P＜0.01)呈明顯正相關(guān)。

2.2 學(xué)習(xí)記憶能力 康復(fù)組大鼠術(shù)后35 d Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)能力(67.34±8.05)，明顯優(yōu)于模型組(102.58±11.73)(t=1.982,P＜0.05)。神經(jīng)功能與學(xué)習(xí)記憶能力呈明顯正相關(guān)(r=0.567,P＜0.01)。

2.3 Syn、Ng表達(dá) 康復(fù)組Syn校正光密度值在術(shù)后35 d優(yōu)于模型組(P＜0.05)；Ng校正光密度值在術(shù)后25 d、35 d均優(yōu)于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表5、表6。

表5 Syn在梗死側(cè)海馬CA3區(qū)的表達(dá)(校正光密度值)

表6 Ng在梗死側(cè)海馬齒狀回的表達(dá)(校正光密度值)

3 討論

Syn為突觸前膜標(biāo)志蛋白，其密度可間接反映突觸的數(shù)量、分布和密度[9]。本研究顯示，梗死側(cè)Syn陽(yáng)性反應(yīng)物主要分布在紋狀體、海馬及下丘腦。在術(shù)后25 d，康復(fù)組陽(yáng)性顆粒數(shù)量明顯增多，顆粒小而密集，染色均勻，可見(jiàn)明顯Syn陽(yáng)性纖維束；術(shù)后35 d康復(fù)組Syn陽(yáng)性纖維排列整齊，較前稍有增多，并可見(jiàn)Syn陽(yáng)性纖維網(wǎng)，校正光密度與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。提示康復(fù)訓(xùn)練可能有促進(jìn)海馬突觸結(jié)構(gòu)的改建和再建。由于突觸素是構(gòu)成突觸囊泡特異性的膜通道，突觸素的增加意味著突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力的增強(qiáng)，傳遞效能增強(qiáng)，推測(cè)康復(fù)訓(xùn)練可能通過(guò)改善突觸的數(shù)量或(和)效能來(lái)改善認(rèn)知能力。

Ng廣泛分布于大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球等重要腦區(qū)的神經(jīng)突觸后。目前研究表明，Ng在神經(jīng)的可塑性及腦部的一些病理生理變化等方面起重要作用，尤其是作為Ca2+敏感性的鈣調(diào)蛋白(calmodulan,CaM)結(jié)合蛋白及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的突觸后底物，參與在學(xué)習(xí)記憶功能中起核心作用的腦內(nèi)幾種蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(1ong-term potentiation,LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(1ong-term depression,LTD)等突觸可塑性機(jī)制，因而它可能涉及學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固[4,10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ng免疫陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕色或棕黃色顆粒狀沉積，在海馬齒狀回內(nèi)呈3條清晰的條帶(內(nèi)、中、外帶)。術(shù)后15 d康復(fù)組和模型組Ng陽(yáng)性顆粒細(xì)小，著色淺淡，沿內(nèi)帶和外帶邊緣呈條索狀不均勻分布；術(shù)后25 d康復(fù)組陽(yáng)性顆粒數(shù)量增多，著色加深，分布變得密集，從內(nèi)帶和外帶逐漸向中帶聚集；術(shù)后35 d康復(fù)組陽(yáng)性顆粒數(shù)量較前明顯增多，著色明顯加深，顆粒也較前增大。校正光密度在術(shù)后25 d康復(fù)組較模型組高(P＜0.05)，術(shù)后35 d康復(fù)組較模型組明顯升高(P＜0.01)，提示康復(fù)訓(xùn)練能夠造成與突觸可塑性密切相關(guān)分子含量的改變，從而引起腦功能的變化。由于Ng是一種不具有酶活性的神經(jīng)元內(nèi)蛋白分子，其對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)與改變細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度相關(guān)。有文獻(xiàn)表明，Ng基因敲除純合子小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的空間學(xué)習(xí)能力障礙。海馬腦片中Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、PKC和cAMP依賴的蛋白激酶的活性在基因敲除純合子小鼠較正常小鼠顯著降低[11]。

認(rèn)知障礙是腦梗死患者最為常見(jiàn)和持久的并發(fā)癥，促進(jìn)腦梗死患者學(xué)習(xí)記憶能力的改善是腦梗死治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)，目前在中樞可塑性研究中，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力改善的康復(fù)機(jī)制備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用Y-型迷宮評(píng)定大鼠逃避條件反射和空間辨別能力，大鼠在Y-型迷宮中學(xué)會(huì)逃避不適刺激所需的訓(xùn)練次數(shù)代表大鼠形成條件反射和整體學(xué)習(xí)能力，次數(shù)越少學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)?？祻?fù)組和模型組大鼠處死前分別進(jìn)行Y-迷宮分辨學(xué)習(xí)結(jié)果為術(shù)后康復(fù)組明顯優(yōu)于模型組(P＜0.05)，表明康復(fù)訓(xùn)練(網(wǎng)狀滾筒訓(xùn)練、平衡木訓(xùn)練、轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練、網(wǎng)屏訓(xùn)練)對(duì)腦梗死大鼠認(rèn)知能力的恢復(fù)有促進(jìn)作用。腦梗死大鼠神經(jīng)功能與各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)功能均呈顯著正相關(guān)，表明認(rèn)知能力可隨著神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)而改善。

余茜等發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可明顯改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能和認(rèn)知能力，使健側(cè)海馬突觸界面曲率和突觸后致密物(PSD)厚度增大，穿孔性突觸的百分率增多，突觸穿孔后致密物變?yōu)楣?jié)段，出現(xiàn)多個(gè)活性區(qū)，使得不同受體簇的不同活性區(qū)傳遞功能大大加強(qiáng)，進(jìn)一步加強(qiáng)了突觸傳遞功能，使其習(xí)得性LTP形成速度明顯快于模型組[12-15]。并指出運(yùn)動(dòng)康復(fù)促進(jìn)腦梗死大鼠認(rèn)知能力的恢復(fù)可能是通過(guò)影響腦梗死鼠健側(cè)海馬CA3區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體通道開(kāi)放導(dǎo)電水平、開(kāi)放時(shí)間和開(kāi)放概率來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？祻?fù)訓(xùn)練后健側(cè)海馬突觸體游離Ca2+濃度變化可影響信息處理過(guò)程，最終表現(xiàn)在認(rèn)知能力行為上。另有研究認(rèn)為，康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)雙側(cè)大腦皮質(zhì)Fos陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)增強(qiáng)[16]，認(rèn)為是細(xì)胞長(zhǎng)期效應(yīng)被激活的標(biāo)志，c-fos基因表達(dá)和Fos蛋白的生物合成對(duì)促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶過(guò)程至關(guān)重要。Tischmeyer等報(bào)道，大鼠在完成Y-型迷宮視覺(jué)辨別任務(wù)后，其海馬c-fos mRNA升高，在清醒大鼠海馬齒狀回誘導(dǎo)LTP可導(dǎo)致c-fos基因表達(dá)增高[17]，表明康復(fù)訓(xùn)練也可通過(guò)提高c-fos基因表達(dá)來(lái)增進(jìn)認(rèn)知能力。

總之，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用可通過(guò)增加Syn和Ng陽(yáng)性表達(dá)改善腦梗死大鼠認(rèn)知能力。

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