不同液體治療方案對患者腦組織含水量、顱內(nèi)壓以及腦組織水通道蛋白-4和N-甲基-D-天冬氨酸受體-1表達(dá)的影響

王 霞，劉 超，張雪寧，閔 蘇，劉 東，魏 珂，董 軍，羅 潔，劉小濱

1天津市人民醫(yī)院急診科，天津 300121

2天津醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院放射科，天津 300211

3重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016

4天津醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300211

神經(jīng)外科圍手術(shù)期腦水腫嚴(yán)重影響手術(shù)進(jìn)行和術(shù)后患者腦功能恢復(fù)。既往研究僅監(jiān)測不同液體治療對患者血流動力學(xué)和腦脊液壓力的影響，對不同液體治療方案對腦組織水轉(zhuǎn)運影響的研究較少，神經(jīng)外科的液體治療方案一直是麻醉界的主要爭論焦點之一，影響臨床恰當(dāng)液體治療方案的制定。中樞神經(jīng)系統(tǒng)水、電解質(zhì)分布失衡與水分子的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)。水通道蛋白家族 (aquaporins，AQPs)可調(diào)節(jié)細(xì)胞水通透性，與腦水腫密切相關(guān)［1-3］，其中AQP-4是腦組織中最主要的AQPs［4］，也是產(chǎn)生細(xì)胞水腫的“最后共同通道”［5］;神經(jīng)元突觸大量釋放的興奮性氨基酸通過N-甲基-D-天門冬氨酸受體 (N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致腦組織中AQP-4等基因的激活從而引起腦水腫及神經(jīng)元凋亡等遲發(fā)性損傷的主要原因［6］。本研究擬在限制液體總量的同時，考察使用不同膠體以及不同晶膠比對患者顱內(nèi)壓、腦組織含水量和腦組織AQP-4、NMDAR-1表達(dá)的影響以及術(shù)后2 h患者的格拉斯哥昏迷量表評分 (Glasgow Coma Scale，GCS)，以揭示圍手術(shù)期腦水轉(zhuǎn)運的機制，探求神經(jīng)外科圍手術(shù)期適宜的液體治療方案。

資料和方法

材料 小鼠抗人AQP-4單克隆抗體 (英國，AbD Serotec公司);兔抗人NMDAR-1單克隆抗體(美國 US Biological公司);4% 琥珀酰明膠 (4%Gelofusine，佳樂施，GEL，沈陽貝朗制藥有限公司);6%中分子羥乙基淀粉200/0.5(6%羥乙基淀粉200/0.5和氯化鈉注射液，商品名賀斯或HES，德國費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司);乳酸鈉林格氏液 (RL，上海百特醫(yī)療用品有限公司);BJM428SOPHYSA型顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)儀 (法國SOPHYSA公司);蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-rad公司);二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒 (上海碧云天生物有限公司);金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)(成都金盤電子科大多媒體技術(shù)有限公司);光學(xué)顯微照相系統(tǒng) (Olympus-45，日本Olympus公司)。

對象 入選標(biāo)準(zhǔn):確診癲癇擬行癲癇灶切除術(shù)的患者，性別不拘，年齡15～45歲，術(shù)前無放療病史和心腦血管病史，美國麻醉師協(xié)會分級Ⅰ～Ⅲ級。排除標(biāo)準(zhǔn):圍手術(shù)期使用血管活性藥物、利尿藥;圍手術(shù)期出血量＞500 ml，需進(jìn)行血制品輸注治療;圍手術(shù)期顱腦感染。研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均于研究前了解研究全部過程并簽署知情同意書。

研究設(shè)計和分組 采用隨機單位組2×2析因設(shè)計:將每例入選對象視為1個單位，對每個單位施以2個處理因素，即膠體因子 (2水平:4%琥珀酰明膠、6%中分子羥乙基淀粉)和晶膠比因子 (2水平:0∶1、1∶1)的所有組合 (共4組，n=8)。通過隨機數(shù)字發(fā)生器將32例患者隨機分為4組 (n=8):Ⅰ組 (4% 琥珀酰明膠，晶膠比0∶1)、Ⅱ組 (6%中分子羥乙基淀粉，晶膠比0∶1)、Ⅲ組 (4% 琥珀酰明膠，晶膠比1∶1)、Ⅳ組 (6%中分子羥乙基淀粉，晶膠比1∶1)(晶體使用乳酸林格氏液)。

麻醉和手術(shù) 芬太尼、維庫溴胺、咪唑安定麻醉誘導(dǎo)，氣管插管保證雙肺良好通氣，以丙泊酚靜脈泵注及七氟醚吸入復(fù)合麻醉維持，間斷給予芬太尼加強鎮(zhèn)痛，維庫溴胺保證肌肉松弛。呼吸參數(shù)設(shè)定:潮氣量8 ml/kg，吸入氧濃度80%，調(diào)整呼吸頻率，保持呼氣末二氧化碳分壓在35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。術(shù)中連續(xù)監(jiān)測血壓、心率和尿量，且所有患者的麻醉由同一組麻醉醫(yī)師完成，所有患者的手術(shù)采用相同的手術(shù)方式，由同一組手術(shù)醫(yī)師完成，留取切除腦組織塊中灶區(qū)的周圍區(qū)域組織塊。

液體治療方案 手術(shù)前1 h分別輸注晶膠比0∶1、1∶1，輸注4%琥珀酰明膠、6%中分子羥乙基淀粉各10 ml/kg，進(jìn)行急性高溶性血液稀釋。術(shù)中液體治療仍按相應(yīng)分組的方案輸注，速度:5ml/(kg·h)。

顱內(nèi)壓持續(xù)監(jiān)測 將BJM428SOPHYSA型顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)儀測量導(dǎo)管植入大腦額葉硬膜下，與顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)儀連接持續(xù)監(jiān)測患者顱內(nèi)壓。每15分鐘記錄患者呼氣相的顱內(nèi)壓數(shù)值，統(tǒng)計時取整個液體治療期間平均值。

材料處理 在去DEPC水制成的冰面上吸除血跡，分離雙側(cè)腦組織為A、B兩份。A份用錫鉑紙標(biāo)記包裹后置于液氮中過夜，然后保存于－80℃超低溫冰箱中，備做Western blot;B份稱量濕重后，置入80℃恒溫電烤箱中烘烤72 h至恒重 (兩次稱重差別≤0.2 mg)。

干燥法測定腦含水量 按照Elliott公式 ［腦組織含水量 =(濕重 －干重)/濕重 ×100%］計算 B份腦組織含水量。

Western blot檢測 AQP-4和NMDAR-1在神經(jīng)元中的表達(dá) 取A份腦組織勻漿0.2 g，經(jīng)Western及免疫沉淀細(xì)胞裂解液提取蛋白，再用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，據(jù)此調(diào)節(jié)蛋白濃度一致。取等量蛋白樣品，用5×SDS加樣緩沖液按1∶1(V/V)稀釋待測樣品，于100℃煮沸5 min;另用1×SDS加樣緩沖液溶解預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)混合物，于100℃煮沸3 min。取待測標(biāo)本15 μl上樣 (甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為蛋白質(zhì)上樣量的標(biāo)定)，經(jīng)SDS-PAGE電泳至預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所示目的相對分子質(zhì)量出現(xiàn)為止，用濕法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，50 g/L脫脂奶粉封閉3 h，加入相應(yīng)抗體 ［小鼠抗人AQP-4單克隆抗體、兔抗人NMDAR-1單克隆抗體 (1∶200)］4℃孵育過夜，使用相應(yīng)辣根酶標(biāo)記IgG(1∶200)37℃孵育2 h，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色，金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)測定陽性條帶的積分光密度值。

格拉斯哥昏迷量表評分 手術(shù)后2 h，在病房對患者進(jìn)行隨訪和格拉斯哥昏迷量表評分。評分由非手術(shù)參與醫(yī)生進(jìn)行，評分過程嚴(yán)格執(zhí)行雙盲原則。

結(jié) 果

顱內(nèi)壓持續(xù)監(jiān)測結(jié)果 6%中分子羥乙基淀粉較4% 琥珀酰明膠以及晶膠比1∶1較晶膠比0∶1均可增加液體治療期間的平均顱內(nèi)壓 (F=55.714，P=0.000;F=142.432，P=0.000);兩者的影響呈相加效果，即晶膠比1∶1和6%中分子羥乙基淀粉兩因素疊加造成患者液體治療期間顱內(nèi)壓進(jìn)一步升高 (F=11.056，P=0.002)(表1)。

腦組織含水量變化 6%中分子羥乙基淀粉較4%琥珀酰明膠以及晶膠比1∶1較晶膠比0∶1均可顯著增加液體治療后的腦組織含水量 (F=31.477，P=0.000;F=84.896，P=0.000);兩者的影響呈相加效果，即晶膠比1∶1和6%中分子羥乙基淀粉兩因素疊加造成患者液體治療后腦組織含水量進(jìn)一步升高(F=8.007，P=0.008)(表2)。

Western blot檢測AQP-4和NMDAR-1在神經(jīng)元中的表達(dá) 6%中分子羥乙基淀粉較4% 琥珀酰明膠以及晶膠比1∶1較晶膠比0∶1均可增加液體治療后的腦組織AQP-4的表達(dá) (F=37.205，P=0.000;F=149.652，P=0.014);兩者的影響呈相加效果，即晶膠比1∶1和6%中分子羥乙基淀粉兩因素疊加造成患者液體治療后AQP-4的表達(dá)進(jìn)一步升高 (F=5.038，P=0.033)(圖1、表3)。

6%中分子羥乙基淀粉較4%琥珀酰明膠以及晶膠比1∶1較晶膠比0∶1均可增加液體治療后的腦組織NMDAR-1表達(dá) (F=29.664，P=0.000;F=65.951，P=0.000);兩者的影響呈相加效果，即晶膠比1∶1和6%中分子羥乙基淀粉兩因素疊加造成患者液體治療后腦組織NMDAR-1表達(dá)進(jìn)一步升高 (F=5.020，P=0.033)(圖1、表4)。

格拉斯哥昏迷量表評分 6%中分子羥乙基淀粉較4%琥珀酰明膠以及晶膠比1∶1較晶膠比0∶1對手術(shù)后格拉斯哥昏迷量表評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(表5)。

表1 不同液體治療期間患者的顱內(nèi)壓變化 (n=8，，kPa)Table 1 Changes of intracranial pressure upon different liquid therapies(n=8，，kPa)

表1 不同液體治療期間患者的顱內(nèi)壓變化 (n=8，，kPa)Table 1 Changes of intracranial pressure upon different liquid therapies(n=8，，kPa)

組別Groups 4%琥珀酰明膠4%gelofusine 6%中分子羥乙基淀粉6%hydroxyethyl starch平均值A(chǔ)verage value F值F value P值P value晶膠比 0∶1 Crystal/gel ratio 0∶1 10.116±0.613 11.166 ±0.576 10.644±0.789 12.485 0.003晶膠比 1∶1 Crystal/gel ratio 1∶1 12.078±0.821 14.817 ±0.826 13.448±1.620 44.298 0.000平均值A(chǔ)verage value 11.097±1.231 12.989±2.004 12.046±1.898 55.714 0.000 F值F value 29.436 105.386 142.432 P值P value 0.000 0.000 0.000

表2 不同液體治療前后患者的腦組織含水量變化 (n=8，，%)Table 2 Changes of brain water content upon different liquid therapies(n=8，，%)

表2 不同液體治療前后患者的腦組織含水量變化 (n=8，，%)Table 2 Changes of brain water content upon different liquid therapies(n=8，，%)

組別Groups 4%琥珀酰明膠4%gelofusine 6%中分子羥乙基淀粉6%hydroxyethyl starch平均值A(chǔ)verage value F值F value P值P value晶膠比 0∶1 Crystal/gel ratio 0∶1 74.954±0.626 75.990 ±1.004 75.472±0.969 6.144 0.027晶膠比 1∶1 Crystal/gel ratio 1∶1 77.339±1.329 80.503 ±1.149 78.921±2.027 25.957 0.000平均值A(chǔ)verage value 74.146±1.588 78.246±2.553 77.196±2.348 31.477 0.000 F值F value 21.103 70.011 84.896 P值P value 0.000 0.000 0.000

表3 水通道蛋白-4在神經(jīng)元中的表達(dá) (免疫印跡法，積分吸光度值)(n=8，)Table 3 Expression of aquaporin-4 in the brain tissue(Western blot，integral absorbance value)(n=8，)

表3 水通道蛋白-4在神經(jīng)元中的表達(dá) (免疫印跡法，積分吸光度值)(n=8，)Table 3 Expression of aquaporin-4 in the brain tissue(Western blot，integral absorbance value)(n=8，)

組別Groups 4%琥珀酰明膠4%gelofusine 6%中分子羥乙基淀粉6%hydroxyethyl starch平均值A(chǔ)verage value F值F value P值P value晶膠比 0∶1 Crystal/gel ratio 0∶1 394.00± 67.98 549.88±102.27 471.94±116.26 12.890 0.003晶膠比 1∶1 Crystal/gel ratio 1∶1 797.88± 92.23 1167.75±116.74 982.81±216.36 49.447 0.000平均值A(chǔ)verage value 595.94±222.76 858.81±336.22 727.38±310.72 37.205 0.000 F值F value 99.397 126.803 149.652 P值P value 0.000 0.000 0.014

圖1 水通道蛋白-4(A)和N-甲基-D-天冬氨酸受體-1(B)在腦中的免疫印跡法的顯影結(jié)果Fig 1 Expressions of aquaporin-4(A)and N-methyl-D-aspartate-1(B)in the brain tissue(Western blot)

表4 N-甲基-D-天冬氨酸受體-1在腦中的表達(dá) (免疫印跡法，積分吸光度值)(n=8，)Table 4 Expression of N-methyl-D-aspartate-1 in the brain tissue(Western blot，integral absorbance value)(n=8，)

表4 N-甲基-D-天冬氨酸受體-1在腦中的表達(dá) (免疫印跡法，積分吸光度值)(n=8，)Table 4 Expression of N-methyl-D-aspartate-1 in the brain tissue(Western blot，integral absorbance value)(n=8，)

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表5 格拉斯哥昏迷量表評分 (手術(shù)后2 h)(n=8，)Table 5 Glasgow coma scores 2 hours after operation(n=8，)

表5 格拉斯哥昏迷量表評分 (手術(shù)后2 h)(n=8，)Table 5 Glasgow coma scores 2 hours after operation(n=8，)

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討 論

目前國內(nèi)常用的膠體為4%琥珀酰明膠和6%羥乙基淀粉［7］。此前，對液體治療的研究僅限于檢測某些生理指標(biāo)的變化，由于研究手段的局限，對于圍手術(shù)期液體治療對腦組織水轉(zhuǎn)運的影響知之較少，較大程度影響了臨床恰當(dāng)液體治療方案的制定。

腦水腫的直接監(jiān)測指標(biāo)是顱內(nèi)壓，而腦含水量改變是腦水腫的最終表現(xiàn)。本研究顯示不同的膠體及不同晶膠比影響手術(shù)中顱內(nèi)壓和術(shù)后腦含水量，琥珀酰明膠優(yōu)于中分子羥乙基淀粉、晶膠比0∶1優(yōu)于1∶1;同時顯示和晶體液不同配比的兩種膠體均不會造成顱內(nèi)壓和腦含水量高于正常水準(zhǔn)。目前，由于缺乏證據(jù)，對于各種膠體在神經(jīng)外科手術(shù)中膠體液的選擇較為盲目，這一結(jié)果或可提供參考。此外，臨床多認(rèn)為常規(guī)手術(shù)中晶膠比1∶1是最佳配比，這與本研究結(jié)果矛盾，可能需要更多研究者探討。

在細(xì)胞內(nèi)外和血管內(nèi)外的水分子轉(zhuǎn)運存在逆濃度梯度的轉(zhuǎn)運過程，這一功能與水通道蛋白密切相關(guān)，即腦內(nèi)微環(huán)境改變導(dǎo)致AQPs表達(dá)上調(diào)［1-3］，引起某些活性物質(zhì)分泌異常，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［8］，增加細(xì)胞膜對水的通透性，從而導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，兩者的變化又進(jìn)一步加劇腦組織含水量的增加，進(jìn)一步促進(jìn)腦水腫的形成［9］。

AQPs是90年代初發(fā)現(xiàn)的一種膜蛋白，廣泛分布于機體的不同組織器官中，介導(dǎo)不同類型細(xì)胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運，目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)13種AQPs亞型 (AQP 0-12)［10］。AQP-4是腦組織中含量最多、分布最廣的水通道蛋白，在腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜、脈絡(luò)叢、下丘腦的視上核和視旁核，對維持腦內(nèi)水平衡發(fā)揮重要的作用［11］。

本研究顯示中分子羥乙基淀粉相對琥珀酰明膠、晶膠比 0∶1相對晶膠比 1∶1，會增加 AQP-4和NMDAR-1在腦中的表達(dá)。這一結(jié)果與 Thrane等［4］、胡惠等［5］和魯宏等［12］研究顯示AQP-4是星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的重要分子基礎(chǔ)、是產(chǎn)生細(xì)胞水腫的“最后共同通道”相一致。此外，Li等［6］研究顯示神經(jīng)元突觸大量釋放的興奮性氨基酸通過NMDAR產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用可能是導(dǎo)致腦組織中AQP-4等基因的激活從而引起腦水腫及神經(jīng)元凋亡等遲發(fā)性損傷的主要原因，這一結(jié)果在本研究同樣得到證實。

另有研究認(rèn)為，AQP-4的功能可能是雙方面的，它可能導(dǎo)致腦水腫性形成和發(fā)展，也可能起到保護(hù)作用，即在大腦局部缺血的病理情況下，AQP-4可能通過調(diào)控水的轉(zhuǎn)運，既參與腦水腫的形成、又參與其消退［13］。其原因可能為:增高的AQP-4可能是機體為調(diào)解細(xì)胞外間隙過多的水分和K+的一種保護(hù)性反應(yīng)，但過度增高的AQP-4會使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的水分增加，從而促進(jìn)細(xì)胞毒性腦水腫的形成［14-15］。這些研究結(jié)合本研究結(jié)果，提示臨床工作者不同的膠體和晶膠比對AQPs及其對腦水轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)的影響很可能是多方面和多方向的。

此外，本研究顯示各種液體治療方案對術(shù)后2 h患者的格拉斯哥昏迷量表評分無明顯影響，且都在安全范圍之內(nèi)，皆可安全使用于神經(jīng)科手術(shù)中;若考慮術(shù)中顱內(nèi)壓的變化因素，則4%琥珀酰明膠較6%中分子羥乙基淀粉、晶膠比1∶1較晶膠比0∶1對腦含水量及顱內(nèi)壓的控制更好，更適合神經(jīng)外科圍手術(shù)期使用。

［1］Oliva AA Jr，Kang Y，Truettner JS，et al.Fluid-percussion brain injury induces changes in aquaporin channel expression ［J］.Neuroscience，2011，180(4):272-279.

［2］Blocher J，Eckert I，Elster J，et al.Aquaporins AQP1 and AQP4 in the cerebrospinal fluid of bacterial meningitis patients ［J］.Neurosci Lett，2011，504(1):23-27.

［3］Ibata K，Takimoto S，Morisaku T，et al.Analysis of aquaporin-mediated diffusional water permeability by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy ［J］.Biophys J，2011，101(9):2277-2283.

［4］Thrane AS，Rappold PM，F(xiàn)ujita T，et al.Critical role of aquaporin-4(AQP-4)in astrocytic Ca2+signaling events elicited by cerebral edema ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(2):846-851.

［5］胡惠，魯宏，何占平.水通道蛋白-4 mRNA沉默可抑制離體缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白-4的表達(dá) ［J］.解剖學(xué)雜志，2011，34(1):355-359.

［6］Li YK，Wang F，Wang W，et al.Aquaporin-4 deficiency impairs synaptic plasticity and associative fear memory in the lateral amygdala:involvement of downregulation of glutamate transporter-1 expression ［J］.Neuropsychopharmacology，2012，37(8):1867-1878.

［7］趙硯麗，張東，霍樹平.兩種羥乙基淀粉急性高容量血液稀釋對病人凝血功能的影響 ［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2005，25(9):716-718.

［8］顧鳳明，張連山.加壓素對大鼠內(nèi)耳水通道蛋白7表達(dá)的影響 ［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2008，30(6):659-662.

［9］李燕華，羅永堅，李呂力，等.腦缺血后AQP-9表達(dá)與血腦屏障通透性的關(guān)系 ［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2008，25(1):33-35.

［10］Ribeiro MC，Hirt L，Bogousslavsky J，et a1.Time course of aquapo rin expression after transient focal cerebral ischemia in mice ［J］.J Neurosci Res，2006，83(7):1231-1240.

［11］張興業(yè)，孫善全，劉輝.局灶性缺血再灌注大鼠AQP 4與Kir 4.1表達(dá)與腦水腫正相關(guān)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(8):785-789.

［12］魯宏，胡惠，何占平.氯化鈷誘發(fā)缺氧對體外星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4表達(dá)的影響 ［J］.中華神經(jīng)科雜志，2011，44(2):117-121.

［13］Lu H，Hu H，He ZP，et al.Reperfusion of the rat brain tissues following acute ischemia:the correlation among diffu-sion-weighted imaging，histopathology，and aquaporin-4 expression ［J］.Chin Med J(Engl)，2011，124(19):3148-3153.

［14］楚燕飛，李兵倉，王建民，等.大鼠顱腦爆炸傷后水通道蛋白-4的表達(dá)變化 ［J］.中國創(chuàng)傷雜志，2006，22(5):377-381.

［15］Dua RK，Devi BI，Yasha TC.Increased expression of Aquaporin-4 and its correlation with contrast enhancement and perilesional edema in brain tumors ［J］.Br J Neurosurg，2010，24(4):454-459.