雙模態(tài)標(biāo)記F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠心臟后離體及在體影像示蹤

曹 劍，王怡寧，石新琳，馬國濤，孔令燕，薛華丹，雷 晶，何泳藍(lán)，金征宇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1放射科 2心外科，北京 100730

近年來，通過干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，文獻(xiàn)報(bào)道在宏觀上能夠觀察到干細(xì)胞治療后心室功能的恢復(fù)，但對(duì)于移植干細(xì)胞的分布分化等生物學(xué)過程尚缺乏深入了解［1-3］。分子影像學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)移植細(xì)胞的動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)、高效和長期示蹤，特別是多模態(tài)成像的方法，將不同的技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來以取長補(bǔ)短，是研究移植干細(xì)胞生物學(xué)過程的關(guān)鍵［4］。本研究以超小超順磁性納米氧化鐵顆粒 (ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)標(biāo)記表達(dá)紅色熒光蛋白的F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇磁共振和光學(xué)兩種成像模式，以期發(fā)揮磁共振成像組織分辨率高及光學(xué)成像敏感性和信噪比高的優(yōu)勢，對(duì)在體雙模成像的可行性進(jìn)行初步探索。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康F344大鼠10只，購自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重250～300 g，性別不限，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所普通級(jí)動(dòng)物房，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行。本研究獲得北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

材料 表達(dá)紅色熒光蛋白 (red fluorescence protein，RFP)的F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone mesenchymal stem cells，BMSCs)及完全培養(yǎng)基 ［賽業(yè) (廣州)生物科技有限公司］，USPIO(Bayer Schering Pharma AG公司惠贈(zèng)，德國)，0.01%多聚賴氨酸 (Sigma，美國)，MTS(Promega，美國)。1.5 T超導(dǎo)型磁共振掃描儀 (Signal Excite HD，GE，美國)，ALC-V8D小動(dòng)物呼吸機(jī) (北京吉安得爾科技有限公司)，PIXIS 1024BR CCD光學(xué)成像系統(tǒng)(中國科學(xué)院自動(dòng)化研究所)。

USPIO標(biāo)記F344大鼠BMSCs 配制濃度為USPIO 40μg Fe/ml、多聚賴氨酸 1.5μg/ml的含鐵培養(yǎng)基，其中多聚賴氨酸作為轉(zhuǎn)染劑，將狀態(tài)良好的BMSCs在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)孵育過夜(24h)，構(gòu)建USPIO-RFP雙標(biāo)BMSCs。

USPIO標(biāo)記的有效性及安全性檢測

普魯士藍(lán)染色:4%多聚甲醛固定雙標(biāo)干細(xì)胞，加入等體積混合的2%亞鐵氰化鉀溶液和2%鹽酸溶液，顯微鏡下觀察，計(jì)算標(biāo)記陽性率;計(jì)數(shù)3次取平均值。

電鏡檢查:(1)USPIO標(biāo)記干細(xì)胞;(2)細(xì)胞固定 (戊二醛、四氧化鋨);(3)丙酮梯度脫水;(4)浸透;(5)包埋;(6)修塊;(7)制備50～60 nm超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，水洗晾干備用;(8)透射電鏡觀察并照相。

臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn):0.05%胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液;取20 μl懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，隨后加入2滴2%臺(tái)盼藍(lán)溶液，顯微鏡隨機(jī)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)總細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) (正?；罴?xì)胞不被染色，而死細(xì)胞被染成藍(lán)色);計(jì)數(shù)3次取平均值，并比較標(biāo)記組細(xì)胞和陰性對(duì)照組活力。

建立F344大鼠心肌梗死模型及心肌注射雙標(biāo)BMSCs 實(shí)驗(yàn)組 (n=8)于腹腔麻醉成功后行氣管穿刺插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣條件下，開胸以6-0聚丙烯縫線結(jié)扎冠脈左前降支，術(shù)中監(jiān)測心電圖，以出現(xiàn)ST段抬高作為心肌梗死成功標(biāo)志。建模成功后約10 min，直視下使用微量注射器于梗死心肌周邊注射雙標(biāo)BMSCs(數(shù)量2.0×106，體積150 μl)，逐層縫合關(guān)胸，觀察15 min后拔管脫機(jī)。對(duì)照組(n=2)不做任何處理。

心臟磁共振成像示蹤標(biāo)記BMSCs 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均行心臟磁共振成像，實(shí)驗(yàn)組分別于雙標(biāo)干細(xì)胞移植后1 d、1周、2周及4周時(shí)進(jìn)行磁共振掃描;對(duì)照組掃描1次即可。大鼠于磁共振檢查前行腹腔麻醉，胸部備皮，粘貼磁共振兼容電極片以實(shí)現(xiàn)心電門控。掃描采用3英寸線圈，選擇快速擾相位梯度回波序列進(jìn)行短軸二腔心平面掃描，具體參數(shù):重復(fù)時(shí)間7.6 ms，回波時(shí)間3.5 ms，視野大小13 mm×13 mm，層厚/層間距2.0/0 mm，矩陣160×160，激勵(lì)次數(shù)4。選取實(shí)驗(yàn)組磁共振圖像信號(hào)減低最明顯的層面，于工作站測量并比較注射細(xì)胞區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度 (signal intensity，SI)變化率:ΔSI=|SIL-SIM|/SIM×100%，其中SIL及SIM分別為信號(hào)減低區(qū)域和正常心肌的信號(hào)強(qiáng)度，各部位所選感興趣區(qū)大小盡量保持一致(1～2 mm2)。

在體光學(xué)成像 磁共振成像結(jié)束后24 h內(nèi)，將F344大鼠經(jīng)腹腔麻醉，仰臥位充分暴露心臟區(qū)域，置于PIXIS 1024BR CCD光學(xué)成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像(綠色熒光激發(fā))。

離體光學(xué)成像 術(shù)后第4周在體光學(xué)成像結(jié)束后將F344大鼠麻醉處死，仰臥固定于操作臺(tái)分離取出心臟，生理鹽水沖洗后將心臟置于光學(xué)成像設(shè)備中，暗室條件下激發(fā)光成像，成像完成后將心臟浸泡在福爾馬林溶液中固定。

病理組織學(xué)檢查 心臟經(jīng)福爾馬林溶液浸泡固定，根據(jù)術(shù)中縫線位置切取梗死區(qū)心肌，脫水、包埋后行石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)、普魯士藍(lán)鐵染色檢查USPIO位置、熒光成像觀察干細(xì)胞分布。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用t檢驗(yàn)對(duì)標(biāo)記組和陰性對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞活力比較，不同時(shí)間點(diǎn)心肌MRI信號(hào)強(qiáng)度變化率 (ΔSI)的比較采用單因素方差分析;P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

USPIO標(biāo)記BMSCs有效性及安全性檢測

普魯士藍(lán)染色:顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)染顆粒，部分聚集成團(tuán)，顆粒分布以核周和靠近細(xì)胞膜處較為明顯;偶見標(biāo)記陰性的細(xì)胞。細(xì)胞平均染色率為99%。

電鏡檢查:透射電鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞，可見核膜完整、核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、可見黑色顆粒USPIO多位于各級(jí)溶酶體內(nèi)。

臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn):于顯微鏡下可見死細(xì)胞被均勻染成藍(lán)色，標(biāo)記組和陰性對(duì)照組活細(xì)胞率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (95.7% 比96.3%，P＞0.05)。

在體磁共振成像 實(shí)驗(yàn)組8只F344大鼠心臟磁共振成像顯示左右心室結(jié)構(gòu)清晰，在左心室前壁可見信號(hào)減低區(qū) (圖1)，不同時(shí)間點(diǎn) (1 d、1周、2周和4周)該區(qū)域心臟信號(hào)減低區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度變化率 (ΔSI)分別為 71.77±5.32、69.60±3.16、68.90±6.56和68.00±5.76，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.66)。對(duì)照組2只F344大鼠心臟磁共振成像顯示左右心室結(jié)構(gòu)清晰，心臟收縮運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，心肌信號(hào)均勻，未見明顯信號(hào)減低或增高區(qū)域。

在體及離體光學(xué)成像 F344大鼠 (實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)在體熒光成像未檢測到心臟區(qū)域有熒光信號(hào)，鼠皮毛產(chǎn)生較高的背景熒光干擾。將心臟取出后，置于與在體熒光成像同樣的激發(fā)光和發(fā)射光條件下進(jìn)行光學(xué)成像，實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟在干細(xì)胞注射部位可以觀察到微弱的熒光 (圖2)。

病理組織學(xué)檢查結(jié)果

HE染色:正常心肌組織結(jié)構(gòu)完整;局部心肌HE染色顯示細(xì)胞輪廓雖然存在，但是細(xì)胞核消失，符合心肌梗死病理表現(xiàn)，其周圍可見細(xì)胞核密度明顯增加，考慮為移植干細(xì)胞。

普魯士藍(lán)染色:HE染色中考慮為干細(xì)胞聚集區(qū)域的部位存在大量藍(lán)染顆粒沉積，其余心肌組織內(nèi)未見明顯藍(lán)染顆粒分布 (圖3)。

圖1 細(xì)胞移植后不同時(shí)間大鼠心臟磁共振成像結(jié)果 (快速擾相梯度回波序列，短軸兩腔心圖像)Fig 1 Magnetic resonance imaging results of rat heart over time after cellular transplantation(fast spoiled gradient echo sequence，shortaxis image)

圖2 離體心臟熒光成像Fig 2 In vitro fluorescence imaging of rat heart

熒光成像:普魯士藍(lán)染色藍(lán)染顆粒分布區(qū)域可見紅色熒光蛋白聚集，其余心肌組織內(nèi)未見明顯紅色熒光蛋白分布 (圖3)。

討 論

本研究將磁共振-光學(xué)雙標(biāo)的BMSCs干細(xì)胞注射至急性心肌梗死F344大鼠的梗死心肌周圍，并對(duì)其進(jìn)行在體和離體的磁共振成像、光學(xué)成像，結(jié)果顯示磁共振可以實(shí)現(xiàn)對(duì)移植干細(xì)胞進(jìn)行在體成像示蹤，而光學(xué)成像在體成像結(jié)果陰性，離體成像于細(xì)胞注射部位可以獲得一定程度的熒光成像。

國內(nèi)外文獻(xiàn)中，有關(guān)大鼠心臟MRI的研究多在小動(dòng)物專用磁共振成像設(shè)備上進(jìn)行，磁場強(qiáng)度達(dá)4.7T、7T甚至更高，配合小動(dòng)物專用的心電、呼吸門控設(shè)備，可以獲得質(zhì)量很高的大鼠或小鼠的心臟磁共振圖像［5］。本研究參照文獻(xiàn) ［6］，利用臨床型1.5T磁共振設(shè)備進(jìn)行F344大鼠心臟磁共振成像，經(jīng)過初步實(shí)驗(yàn)，本研究基本掌握了大鼠心臟磁共振成像的技術(shù)，為今后進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。

圖3 4周時(shí)大鼠心臟普魯士藍(lán)染色 (×200)(A)和熒光成像 (×400)(B)Fig 3 Prussian-blue staining(×200)(A)and fluorescence imaging(×400)(B)of the rat heart on week 4

本研究通過計(jì)算SI變化率觀察雙標(biāo)BMSCs移植后心肌信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長 (4周內(nèi))，SI并未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。文獻(xiàn)報(bào)道USPIO/SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞凋亡后殘留的鐵顆粒會(huì)留下偽影［7］。另外，Zhang等［8］的研究指出巨噬細(xì)胞中存在一定量殘留的SPIO顆粒并停留在心肌部位。這些殘留的鐵顆粒成為一個(gè)假陽性信號(hào)，對(duì)利用MRI長期在體示蹤干細(xì)胞帶來一定的干擾。本研究選用USPIO-RFP雙標(biāo)干細(xì)胞，是為了克服磁共振成像假陽性的缺陷，相互印證，提高干細(xì)胞移植后在體監(jiān)測的準(zhǔn)確性。

以在體光學(xué)成像為基礎(chǔ)的小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已有不少，但這些研究所利用的小動(dòng)物模型多為小鼠或裸鼠，涉及大鼠的也多是皮下在體成像，其中結(jié)合MRI技術(shù)進(jìn)行的雙模態(tài)成像相對(duì)更少［9］。本研究采用大鼠模型進(jìn)行心臟在體光學(xué)成像，經(jīng)驗(yàn)少、難度大，雖然最終未能獲得理想的在體熒光圖像，但是仍然有不少收獲。根據(jù)本研究體外對(duì)標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果及光信號(hào)的衰減規(guī)律，如果注入體內(nèi)的熒光基團(tuán)距體表深度為1cm，要達(dá)成近似體外成像的效果，注入的細(xì)胞數(shù)至少要達(dá)到107，然而實(shí)際顯示，此濃度的細(xì)胞液幾乎無法制成單細(xì)胞懸液，無法通過注射移植。組織深度對(duì)光學(xué)信號(hào)的影響很大，并且激發(fā)熒光成像的方法存在兩次衰減，對(duì)熒光基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)度要求較高。因此，筆者認(rèn)為可從以下方面對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn):(1)提高光學(xué)標(biāo)記細(xì)胞的效率或選擇熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的熒光基團(tuán):提高內(nèi)源性試劑如RFP在細(xì)胞中的表達(dá)效率可以獲得更強(qiáng)的熒光信號(hào)，另外，新型的RFP正在不斷地被篩選出來，如mCherry，Katushka等紅色熒光蛋白被報(bào)道有著更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和更接近于近紅外光波段的發(fā)射光波長［10］，對(duì)于在體熒光成像相對(duì)于普通的RFP有著更大的優(yōu)勢;(2)可以嘗試用螢火蟲熒光素酶的在體生物發(fā)光成像:以螢火蟲熒光素酶為光學(xué)信號(hào)標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行在體示蹤的文獻(xiàn)報(bào)道雖然多以小鼠模型為基礎(chǔ)［8，11］，但從理論上，在體生物發(fā)光只需要經(jīng)過一次組織的衰減作用，與熒光成像相比有一定優(yōu)勢。

本研究是對(duì)雙模態(tài)成像在體示蹤干細(xì)胞的初步探索，尚存在一定的不足。首先，動(dòng)物數(shù)量少，分組情況有待進(jìn)一步細(xì)化;其次，隨訪觀察時(shí)間尚較短，未能對(duì)USPIO標(biāo)記的遠(yuǎn)期示蹤效果進(jìn)行評(píng)估;再次，缺少對(duì)干細(xì)胞治療效果的短期和長期研究，在接下來的研究中可以通過測定心功能的變化，對(duì)病理切片進(jìn)行定量分析，評(píng)估干細(xì)胞治療的效果和分化情況。

綜上，USPIO-RFP雙標(biāo)F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射急性梗死心肌周圍后，磁共振成像可以實(shí)現(xiàn)對(duì)雙標(biāo)干細(xì)胞的在體示蹤，離體光學(xué)成像和病理分析亦可以實(shí)現(xiàn)對(duì)雙標(biāo)干細(xì)胞的示蹤，而在體光學(xué)成像示蹤雙標(biāo)干細(xì)胞有待進(jìn)一步探索。

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