水稻重要農(nóng)藝性狀的QTL定位

刁林林，趙宏偉，王敬國，劉化龍，趙 雪，孫 健，鄒德堂

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)活全世界近一半的人口。然而水稻的許多重要農(nóng)藝性狀都是多基因控制的數(shù)量性狀，受環(huán)境條件影響較大。盡管目前國際上遺傳育種工作者的大部分研究都圍繞數(shù)量性狀的改良，但要精確利用數(shù)量性狀育出優(yōu)質(zhì)多抗的超高產(chǎn)品種還比較困難，其原因主要是數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)研究得不夠透徹。20世紀80年代以來，分子標(biāo)記的興起和QTL定位方法的改進，為精細研究數(shù)量性狀提供了有效手段，使研究水稻各種農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)成為了可能，可以使育種家們在作物的遺傳機理上提高水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)，為實現(xiàn)水稻的高產(chǎn)高質(zhì)提供了大量的理論依據(jù)。在先前的研究中，已經(jīng)對水稻的數(shù)量性狀進行了大量的定位研究。包括：產(chǎn)量、株高、抽穗期等重要性狀。Yu等用250個F2∶3家系，共檢測到32個影響產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的QTLs，并檢測到大量互作位點對產(chǎn)量及其構(gòu)成因子有顯著作用[1]。鄭景生等用區(qū)間定位法分別檢測到3個控制水稻生育期、株高的QTL，還檢測到2個影響結(jié)實率和千粒重的QTLs[2]。馬大鵬等利用水稻重組自交系群體對產(chǎn)量相關(guān)性狀進行了QTL定位，共檢測到38個QTLs，各性狀QTL的累積表現(xiàn)貢獻率達21.3%～79.5%[3]。葉少平等在第12條染色體上檢測到了控制千粒重的QTL[4]。Zhuang等使用F2和F3群體對每穗實粒數(shù)，每穗穎花數(shù)等8個性狀進行了QTL定位，共檢測到44個QTLs，并討論了不同環(huán)境對QTL定位的影響[5]。Xing等利用重組自交系群體，對單株產(chǎn)量及其構(gòu)成因子進行了QTL定位，共檢測到了29個主效QTLs[6]。但是，由于全球物種遺傳多樣性和數(shù)量性狀基因QTLs的特殊性，這方面的研究還需要不斷加強。傳統(tǒng)的研究主要是秈粳稻雜交為試驗材料，而秈粳稻雜交不適合與北方的種植條件，根據(jù)實際的生產(chǎn)要求，應(yīng)更主要的是研究粳粳稻雜交育種。

本試驗以粳粳稻東農(nóng)422與東農(nóng)427雜交，所產(chǎn)生的F2∶3群體為試驗材料，利用在親本間表現(xiàn)明顯多態(tài)性的76對SSR引物對該群體進行多態(tài)性信息分析，QTL定位結(jié)果是最終在水稻的12條連鎖群上，共定位到28個控制水稻株高、千粒重、穗長、有效穗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)及抽穗期的QTLs，這些試驗結(jié)果為后續(xù)的粳粳稻定位QTL提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以遺傳差別較大的生產(chǎn)推廣的優(yōu)質(zhì)水稻品種東農(nóng)422和東農(nóng)427作為親本，雙親雜交所衍生的F2∶3群體共180份株系作為研究對象。

1.2 農(nóng)藝性狀的調(diào)查

于2010年將供試材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗實習(xí)基地。4月18日播種，5月15號移栽。隨機區(qū)組設(shè)計，單行區(qū)，每行種植40棵，常規(guī)栽培管理同一般田間生產(chǎn)。在每一行內(nèi)隨機取3株，3次重復(fù)，調(diào)查各農(nóng)藝性狀，取3次調(diào)查結(jié)果的平均值。

①株高（cm）：自地面量至一株中最高植株的穗頂（不包括芒）的高度。

②有效穗數(shù)（個）：有效穗標(biāo)準(zhǔn)為有10個灌漿籽粒以上視為有效分蘗，數(shù)單株的有效分蘗數(shù)。

③穗長（cm）：單株所有有效穗穗頸節(jié)到頂花穎尖長度的平均值。

④千粒重（g）：稱量單株內(nèi)1 000粒飽滿谷粒重量。

⑤一次枝梗數(shù)（個）：計算全株內(nèi)每一個穗的枝梗數(shù)（有兩粒谷粒以上的視為一次枝梗），再求其平均值。

⑥二次枝梗數(shù)（個）：計算全株內(nèi)每一個穗的第二次枝梗數(shù)，再求其平均值。

⑦抽穗期調(diào)查（d）：從播種到抽穗的天數(shù)記為抽穗期。

1.3 分子標(biāo)記分析及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

苗期在每一家系內(nèi)隨機選取5株新鮮葉片，提取家系及親本樣品的總DNA[7]，共篩選SSR引物600對。利用篩選出的引物進行PCR擴增，反應(yīng)總體積為 20 μL，體系包括3 μL的模板 DNA（25 ng·μL-1），2 μL 10×PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2（25 mmol·L-1），2 μL SSR 引物（12 ng·μL-1），0.2 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.3 μLTaq酶（5 U·L-1），ddH2O補足至20 μL，最后加入液體石蠟覆蓋體系。PCR擴增步驟包括94℃預(yù)變性6 min，94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，35個循環(huán)，4℃保存。

本研究將來源于親本東農(nóng)422（父本）帶型記為A，來源于東農(nóng)427（母本）帶型記為B，雙親雜合帶型記為H，缺失記為“-”。運用Mapmaker/Exp 3.0作圖軟件進行連鎖圖譜的構(gòu)建，應(yīng)用Group命令進行連鎖分析和分組（LOD=3.0），連鎖標(biāo)記少于8個的用Compare命令進行優(yōu)化排序，多于8個的用Ripple命令排序，錯誤檢測水平設(shè)為1%，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換成遺傳圖距（cM），采用Mapchart2.1進行遺傳連鎖圖譜的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型值分析

所考察的7個性狀的表型統(tǒng)計參數(shù)值和表型分布見表1。參照親本的各性狀表現(xiàn)，后代群體的各性狀表現(xiàn)多種多樣，具有兩親本的各種重組類型，并表現(xiàn)出許多超親現(xiàn)象，并呈連續(xù)分布，因此可以推測各性狀受多基因控制。這符合數(shù)量性狀的特點，適合于QTL作圖分析。

2.2 引物的篩選及多態(tài)率

根據(jù)網(wǎng)上公布的水稻分子遺傳圖譜，選覆蓋水稻12條染色體的600對SSR引物在東農(nóng)422與東農(nóng)427間進行多態(tài)性檢測，有76對引物在雙親間表現(xiàn)明顯多態(tài)性，平均多態(tài)性引物比率為12.8%，大多數(shù)引物對不能擴增出特異性條帶，或擴增條帶的重復(fù)性差，未納入多態(tài)性信息分析中，標(biāo)記在連鎖群上的分布是不同的，其中分子標(biāo)記最多的染色體為第6號染色體，其上有12個標(biāo)記；最少的是12號染色體，其上有2個標(biāo)記。其中篩選出多態(tài)性引物最多的染色體是Chr6和Chr7，每條染色體上分別有12和10對特異性引物。其中第7條染色體上篩選出來特異性引物的多態(tài)性引物比率最大為18.5%，而第12條染色體上篩選出來特異性引物的多態(tài)性標(biāo)記比率最小，僅為4.7%。分子標(biāo)記間的平均遺傳距離為31.36 cM，最遠的為88 cM，最近的為2.9 cM。標(biāo)記間距離很大的區(qū)段還是普遍存在的，所以還需要更多的分子標(biāo)記來加密遺傳圖譜，以減少圖距。

表1 7個性狀在雙親間的差異以及在F2∶3群體中的變異Table 1 Difference of seven traits between parents and among the F2∶3population from the cross of Dongnong422×Dongnong427

2.3 主要農(nóng)藝性狀的QTL分析

對所考察的株高、千粒重、有效穗數(shù)、穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)及抽穗期進行QTL定位分析。

本研究在水稻的12個連鎖群上共檢測到28個QTLs，在第1、4、5、6、7、8、10、11和12號染色體上都有分布，單個表型貢獻率從3.13%～38.03%。其中主要集中在第6和7號染色上，其上分別檢測到8個QTLs和5個QTLs，且在這兩條染色體的相應(yīng)區(qū)段上存在著同時控制多個性狀的QTL密集區(qū)。

由圖1、表2可知，共檢測到5個控制株高的QTLs，分別位于第1、4、5和10條染色體上，其單個貢獻率從5.71%～23.13%，其加性效應(yīng)從-2.50到1.10。

共檢測到2個控制有效穗數(shù)的QTLs，都是位于第6條染色體上，分別位于第6條染色體的RM494-RM345與RM162-RM217的區(qū)間上，表型貢獻率分別為10.12%～9.63%。

共檢測到4個控制千粒重的QTLs，分別位于第6、第7、第8、第12條染色體上，其單個貢獻率從9.87%～27.88%，其加性效應(yīng)從-3.02到1.87。

共檢測到6個控制穗長的QTLs，分別位于第5、第7、第8條染色體上，且在第8條染色體上的3個區(qū)段RM25-RM458，RM44-RM1345，RM1345-RM264檢測到了3個QTLs。

共檢測到2個控制一次枝梗數(shù)的QTLs，都是位于第6條染色體上，分別位于第6條染色體上的RM494-RM345與RM217-RM528的兩個區(qū)段內(nèi)。其貢獻率分別為8.01%與23.03%。

本研究中分別在第1、第3、第6、第7、第11條染色體上定位出了影響水稻抽穗期的QTLs，表型貢獻率從3.13%～30.10%，加性效應(yīng)從-0.02到0.43。

圖1 水稻農(nóng)藝性狀的QTL定位Fig.1 Location of agronomic traits in rice

表2 水稻農(nóng)藝性狀的QTL定位和效應(yīng)分析Table 2 Effect analysis and QTL location of agronomic traits in rice

3 討論

水稻的株高是重要的農(nóng)藝性狀之一，直接關(guān)系到水稻品種的株型，抗倒伏性，區(qū)域布局與產(chǎn)量構(gòu)成。祝莉莉等利用水稻品系B50與秈稻品種明恢630為親本得到的重組自交系群體在第1與第7號染色體上檢測到控制株高的QTLs，總表型變異率達到74.9%[8]。Liu等利用IR64/Azucena的DH群體檢測到控制株高的15個QTLs，其中8個具有加性效應(yīng)，1個QTL具有加性與環(huán)境的互作效應(yīng)[9]。Jiang等利用珍汕97/武育粳2號的DH群體，定位了控制株高的12個QTLs，分別位于1、2、3、9號染色體上各1個QTLs，6、7、8、12號染色體上各2個QTLs，總共解釋53.9%的表形變異[10]。目前，已定位的水稻株高QTL已有900多個（http://www.gramene.org.cn），在12條染色體上都有分布，但主要集中在第1、2、3、4和5條染色體上。本試驗所得到的控制株高的QTLs主要分布在1、4、5、10號染色體上有相同的染色體分布。雖然能檢測到相同的染色體，但并沒有找到相同的分子標(biāo)記，這說明了不同品系間的基因型差異。

利用分子標(biāo)記進行水稻千粒重的QTL定位有不少的報道。Li等利用CSSLs群體在水稻的第3條染色體上檢測到影響千粒重的QTL[11]。Xie等在水稻的第8與第9條染色體上檢測到影響千粒重的QTL[12]。徐建龍等在9條染色體的l7個區(qū)域檢測到影響粒重及相關(guān)性狀的主效QTLs 48個[13]。李澤福等用Nipponbare Kasalath/nipponbare回交重組自交系檢測到的5個控制千粒重的QTLs，共解釋性狀變異的66.9%，分布在3條染色體上，單個QTL的貢獻率在6.6%～31.1%之間[14]。從以上對比結(jié)果來看，很多控制產(chǎn)量性狀QTL在不同的群體和環(huán)境中檢測的結(jié)果在各個染色體上都有分布，大不相同，但有交叉的部分。本研究在第4、第6、第7、第8、第12號染色體上檢測到影響千粒重的QTLs，前人的報道幾乎都可以檢測到。

穗長是水稻產(chǎn)量的重要構(gòu)成因子之一，利用分子標(biāo)記對穗長的QTL定位也有許多報道，但結(jié)果存在較大差異。Zhuang等利用F2和F3群體在第2和第8號染色體上檢測到2個影響穗長的QTLs基因。Lu等利用DH系群體在第6號染色體上檢測到1個影響穗長的QTL基因[15]。本研究中我們通過SSR標(biāo)記進行穗長基因QTL定位，在第5、第7、第8號染色體上檢測到影響穗長的QTLs，在先前的報道中都有檢測到，也進一步豐富了穗長性狀QTL研究的成果，為穗長基因的精細定位提供了有力的佐證。

關(guān)于有效穗數(shù)的QTL報道較少，封功能等共檢測到12個QTLs，分布于第2、3、4、5、6、7、8、9、10號染色體上，其中qPN4-3既有加性效應(yīng)，并且加性效應(yīng)顯著[16]。Xiao等用9024/LH422重組自交系檢測到位于第4條染色體區(qū)段上的控制有效穗數(shù)的一個主效QTL（qPN-4）[17]。Liao等利用一個重組自交系群體，在兩種不同環(huán)境下共檢測到9個控制有效穗數(shù)的QTLs，其中有3個在不同環(huán)境中同時表達[18]。劉桂富等利用DH群體在水稻的第1、4、10、12條染色體上檢測到了影響穗數(shù)的4個QTLs[19]?？梢?，幾乎在各條染色體上都有關(guān)于控制有效穗數(shù)的QTL存在。本試驗中，只在第6條染色體上檢測到兩個影響水稻有效穗數(shù)的QTLs。

很多國內(nèi)外研究者對一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)也有部分研究，Lin等在F2群體上檢測到在第8條染色體上1個對一次枝梗數(shù)貢獻率為20.9%的QTL[20]。陳順強等利用DH群體在第1、8及第10條染色體上的相應(yīng)區(qū)段檢測到了3個控制一次枝梗數(shù)的QTLs，在第1和10兩條染色體檢測到了兩個控制二次枝梗數(shù)的QTLs[21]。本研究中只在第6條染色體上檢測到兩個控制一次枝梗數(shù)的QTLs，而且并沒有檢測到控制二次枝梗數(shù)的QTLs。這可能與試驗所用的材料、構(gòu)建的群體，試驗環(huán)境不同有關(guān)。

水稻的抽穗期是重要的農(nóng)藝性狀之一，對水稻抽穗期進行遺傳性分析有利于了解短日植株的開花習(xí)性和對水稻品種的改良。利用分子標(biāo)記進行水稻抽穗期QTL定位已有不少研究報道，所定位出的控制抽穗期的QTLs在各個染色體上都有報道，但主要集中在第6、7和8條染色條上[22]。李仕貴等認為迄今已報道了28個控制水稻抽穗期的主效基因，則集中分布在水稻第6、第7、第10條染色體上[23]。Li等利用Lement/Teqing組合的F4群體定位了3個抽穗期QTL[24]。Yu等利用Zhanshan 97/Minghui 63的F2∶3代的240個家系檢測到6個抽穗期QTL和許多對抽穗期有顯著影響的互作QTL[1]。Zhou利用1個秈粳交組合的DH群體定位了19個抽穗期QTL[25]。本試驗是在第1、第3、第6、第7、第11號染色體上檢測到影響抽穗期的QTLs，這與前人報道的有交叉的染色體分布結(jié)果大體一致。

4 結(jié)論

本研究所得出的結(jié)果是在水稻的12條連鎖群上，共檢測到28個控制水稻株高、千粒重、穗長、有效穗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)及抽穗期的QTLs，具體的定位結(jié)果如下：

①共檢測到5個控制水稻株高的QTLs，分別位于第1、第4、第5、第10條染色體上，其單個貢獻率5.71%～23.13%。

②共檢測到2個控制有效穗數(shù)的QTLs，都是位于第6條染色體上，貢獻率分別為10.12%與9.63%，其中位于RM494-RM345區(qū)段的QTL為主效QTL。

③共檢測到4個位于第6、第7、第8、第12條染色體上控制千粒重的QTLs，其單個貢獻率9.87%～57.88%。

④共檢測到6個分別位于第5、第7、第8條染色體上，控制穗長的QTLs，其中位于第8條染色體RM1345-RM264區(qū)段所檢測到的貢獻率達到34.42%。

⑤共檢測到2個都是位于第6條染色體上控制一次枝梗數(shù)的QTLs，分別位于第6條染色體上的RM494-RM345與RM217-RM276兩個區(qū)段內(nèi)。其貢獻率分別為8.01%與23.03%。

⑥共檢測到9個位于第1、第3、第6、第7、第11條染色體影響水稻抽穗期的QTLs，表型貢獻率3.13%～50.10%。

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