甘氨酸對大鼠前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位影響的研究

劉宇煒，黃 丹，陳曉青，許曉利，艾永循

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

甘氨酸對大鼠前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位影響的研究

劉宇煒，黃 丹，陳曉青，許曉利，艾永循

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

目的：研究甘氨酸對大鼠前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位的影響。方法：大鼠前額葉皮質(zhì)切片，全細胞膜片鉗記錄錐體神經(jīng)元串連動作電位。結(jié)果：甘氨酸（300 μmol∕L）可顯著降低大鼠前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位的發(fā)放頻率，其作用可被番木鱉堿（1 μmol∕L）所阻斷，表明其作用部位為番木鱉堿依賴性甘氨酸受體。甘氨酸還引起膜超極化，延長動作電位的潛伏期，加快復(fù)極化進程。結(jié)論：前額葉皮質(zhì)的甘氨酸受體可能在VTA-NAcc-PFC神經(jīng)環(huán)路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

甘氨酸；前額葉皮質(zhì)；動作電位

前額葉皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）在許多高級神經(jīng)系統(tǒng)活動中起關(guān)鍵的作用［1］，它是腦內(nèi)獎賞回路的一個重要組成部分，與腹側(cè)被蓋區(qū)（ven?tral tegmental area，VTA）及伏隔核（nucleus accum?bens，NAcc）之間存在著非常密切的交互聯(lián)系［2］。前額葉皮質(zhì)損傷可能導(dǎo)致行為失控與情緒異常［3］，并且與藥物成癮性行為密切相關(guān)［4］。

甘氨酸（glycine，Gly）是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對人體多項生理功能有重要的調(diào)節(jié)作用［5］。通過結(jié)合到甘氨酸受體，甘氨酸能促進快速的氯離子電流。甘氨酸受體主要分布在脊髓、延髓，其在腦干、皮質(zhì)等處的表達也有報道［6］，但其對前額葉皮質(zhì)的調(diào)控作用研究尚不明確，本實驗旨在探討甘氨酸對前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley大鼠，鼠齡17～30天，雌雄不限，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

甘氨酸（glycine）和番木鱉堿（strychnine）購自Sigma公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

孵育液（mmol∕L）：glycerol 250，KCl 1.6， NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH值至7.3。

人工腦脊液（ACSF）（mmol∕L）：NaCl 125，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH值至7.3。

電極內(nèi)液（mmol∕L）：K gluconate 135，KCl 5，MgCl22，HEPES 10，Mg ATP 2，GTP 0.2，調(diào)pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 大鼠前額葉皮質(zhì)腦片的制備 參照筆者以前的實驗方法［7］，并在此基礎(chǔ)上稍加改進：無菌條件下迅速將大鼠斷頭取腦，置于混合氣（95%O2∕5%CO2）飽和的冰冷（0～4℃）孵育液中約5 min。在0℃通混合氣條件下，采用振動切片機（VF-300，美國Precisionary公司）將前額葉皮質(zhì)腦組織切成250 μm厚的冠狀切片，置于混合氣飽和的孵育液中，室溫（22～24℃）下孵育至少1 h以上。

1.2.2 電生理記錄 玻璃微電極由P-97電極拉制儀（美國Sutter公司）分兩步拉制，充灌電極內(nèi)液后阻抗為4～6 MΩ。將腦片置于操作臺正中約0.4 mL凹槽內(nèi)，用一鉑金環(huán)壓住。BX51正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下選大鼠前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元。全細胞膜片鉗記錄所用儀器為Axo?patch 700B膜片鉗放大器（美國Molecular公司），在電極與細胞膜之間形成高阻（1～5 GΩ）封接后，進一步將膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償。數(shù)據(jù)以5 kHz過濾，使用Axonscope 1.1.1 acquisition軟件通過Axon DigiData-1440A記錄于電腦上。整個記錄過程中采用混合氣飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流，灌流速度約2 mL∕min。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0進行處理、統(tǒng)計分析和制圖。實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±S)表示，統(tǒng)計結(jié)果采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘氨酸降低前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位數(shù)量

本實驗所用的78個PFC神經(jīng)元均為錐體形，直徑約15～35 μm，靜息膜電位范圍為-49～-75 mV。93.5%的細胞對外加甘氨酸（300 μmol∕L）敏感。如圖1A所示，給予400 ms時長的去極化電流脈沖可引起一定數(shù)量的串連動作電位，每次脈沖之間間隔為30 s。為便于比較，本研究將初始階段對照組引出的動作電位數(shù)目控制為6個（外加去極化電流50～100 pA）。待其穩(wěn)定后，持續(xù)記錄5 min，然后灌流甘氨酸（300 μmol∕L）3 min，甘氨酸能明顯減少串連動作電位數(shù)量。停止給藥后繼續(xù)用人工腦脊液灌流，串連動作電位數(shù)量逐漸直至完全恢復(fù)，表明甘氨酸的作用為可逆性的。

提前持續(xù)給予一種甘氨酸受體拮抗劑——番木鱉堿（strychnine，Str）（1 μmol∕L）情況下，再重復(fù)上述實驗（圖1），研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸不再引起串連動作電位數(shù)量變化，其抑制作用被番木鱉堿所阻斷，表明其在前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元上作用部位為番木鱉堿依賴性的甘氨酸受體作用位點。

2.2 甘氨酸對前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元動作電位特性的影響

圖1 甘氨酸降低前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元串連動作電位數(shù)量

如圖2A所示，本研究將甘氨酸作用前后的串連動作電位重疊放在一起比較，發(fā)現(xiàn)甘氨酸（300 μmol∕L）作用后，引起細胞膜電位發(fā)生一定程度超極化，靜息膜電位值降低；動作電位高度未發(fā)現(xiàn)顯著性改變；第1次引起動作電位的時間（潛伏期）明顯延長，藥物作用達到最大后，同樣條件的去極化電流僅能引起兩次動作電位，接下來的近250 ms去極化電流均不能刺激動作電位的發(fā)放。研究進一步將甘氨酸作用前后的動作電位做平均化處理，將兩個平均化之后動作電位再做標(biāo)準(zhǔn)化（normalization）疊加在一起（圖2B）?？梢钥吹剑拾彼嶙饔弥?，動作電位的去極化進程未見明顯變化，而復(fù)極化過程加快；動作電位半幅時程（half-width）值有所減小。

圖2 甘氨酸對前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元動作電位特性的影響

以上統(tǒng)計結(jié)果詳見表1。

表1 甘氨酸（300μmol/L）對前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元動作電位特性的影響

3 討論

甘氨酸是中樞神經(jīng)內(nèi)重要的抑制性遞質(zhì)，但其也有興奮性功能。一種情況是作為輔助激動劑（co-agonist）參與激動NMDA受體；另一種情況是在中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)大部分區(qū)域，新生兩周以內(nèi)，細胞內(nèi)Cl-濃度比胞外高，GABA和甘氨酸作用下能引起Cl-外流而產(chǎn)生興奮性作用，兩周以后則由于胞內(nèi)Cl-濃度的下降而轉(zhuǎn)變成抑制性作用［8］。

中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核和前額葉皮質(zhì)及其遞質(zhì)聯(lián)系形成的腦獎賞環(huán)路（VTA-NAcc-PFC神經(jīng)環(huán)路）是藥物獎賞效應(yīng)產(chǎn)生的重要解剖學(xué)基礎(chǔ)，成癮的中樞作用位點大部分集中于此環(huán)路，而學(xué)習(xí)與記憶則集中于海馬、杏仁體和皮質(zhì)，所有這些區(qū)域均參與了成癮、學(xué)習(xí)與記憶中起關(guān)鍵作用的環(huán)路［10］。其中，前額葉皮質(zhì)直接接受來自腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)纖維支配，與以上情感行為、學(xué)習(xí)與記憶等諸多腦的高級功能密切相關(guān)，而前額葉皮質(zhì)反過來又與腹側(cè)被蓋區(qū)和伏隔核有廣泛的交互聯(lián)系［1-4］。這一環(huán)路在生理與病理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。前額葉皮質(zhì)損傷或異常調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致行為失控與情緒異常［3］，并且與藥物成癮性行為密切相關(guān)［4］。

以前有文獻報導(dǎo)番木鱉堿敏感的甘氨酸受體存在于新生大鼠的前額葉皮質(zhì)［9］，一般認為成年后，這些甘氨酸受體就消失了。通過對17～30天SD大鼠作腦片膜片鉗記錄，本研究發(fā)現(xiàn)，具有功能活性的甘氨酸受體在成年的SD大鼠前額葉皮質(zhì)仍然存在。在給予甘氨酸（300 μmol∕L）情況下，其對動作電位的影響為抑制作用，表明其增加Cl-內(nèi)流，進而引起細胞膜超極化，使神經(jīng)元興奮性降低，而導(dǎo)致同樣條件下去極化電流引起的串連動作電位數(shù)量減少。其作用可被番木鱉堿（1 μmol∕L）所阻斷，證實在前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元上存在有功能性的番木鱉堿依賴性甘氨酸受體，這對于調(diào)節(jié)前額葉皮質(zhì)的功能有重要的意義。進一步分析動作電位的特性，甘氨酸可延長動作電位的潛伏期，加快復(fù)極化進程，表明其作用可能主要提高了K+外流速度。

牛磺酸（taurine）是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)范圍內(nèi)的內(nèi)源性甘氨酸受體激動劑，其作用與甘氨酸類似。由于有番木鱉堿依賴性甘氨酸受體的存在，在生理或病理條件下，?；撬峥赏ㄟ^對前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元的影響，可能對VTANAcc-PFC神經(jīng)環(huán)路的調(diào)控起到重要的作用，其具體的作用機制有待進一步研究。

［1］Yevenes G E，Zeilhofer H U.Allosteric modulation of glycine receptors［J］.Br J Pharmacol，2011，164（2）：224-236.

［2］Baer K，Waldvogel H J，F(xiàn)aull R L，et al.Localization of glycine receptors in the human forebrain，brainstem，and cervical spinal cord：an immunohistochemical re?view［J］.Front Mol Neurosci，2009，2：1-11.

［3］Vázquez-Borsetti P，Cortés R，Artigas F.Pyramidal neurons in rat prefrontal cortex projecting to ventral teg?mental area and dorsal raphe nucleus express 5-HT2A receptors［J］.Cereb Cortex，2008，19（7）：1678-1686.

［4］Lu H，Lim B，Poo M M.Cocaine exposure in utero al?ters synaptic plasticity in the medial prefrontal cortex of postnatalrats［J］.JNeurosci，2009，29（40）：12664-12674.

［5］Tromp do P M，Grupe D W，Oathes D J，et al.Re?duced structural connectivity of a major frontolimbic pathway in generalized anxiety disorder［J］.Arch Gen Psychiatry，2012，69（9）：925-934.

［6］Toda S.The role of the striatum in addiction［J］.Brain Nerve，2012，64（8）：911-917.

［7］Liu Y W，Li J，Ye J H.Histamine regulates activities of neurons in the ventrolateral preoptic nucleus［J］.J Physiol，2010，588（Pt 21）：4103-4116.

［8］Ye J H，Wang F，Krnjevic K，et al.Presynaptic gly?cine receptors on GABAergic terminals facilitate dis?charge of dopaminergic neurons in ventral tegmental ar?ea［J］.J Neurosci，2004，24：8961-8974.

［9］Kilb W，Hanganu I L，Okabe A，et al.Glycine recep?tors mediate excitation of subplate neurons in neonatal rat cerebral cortex［J］.J Neurophysiol，2008，100（2）：698-707.

［10］郭萍，錢剛，凌鋅，等.嗎啡精神依賴大鼠VTA-NAc-PFC神經(jīng)環(huán)路谷氨酸含量和NR2B表達的變化［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（5）：471-474.

Effects of Glycine on Trains of Action Potentials in Pyramidal Neurone of Rat Prefrontal Cortex

LIU Yu-wei，HUANG Dan，CHEN Xiao-qing，XV Xiao-li，AI Yong-xun
（School of Medicine，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Objective：To study the effect of glycine on trains of action potentials in pyramidal neurone of rat prefrontal cortex.Methods：Rat prefrontal cortex slices were prepared.Trains of ac?tion potentials were investigated using whole-cell patch-clamp recording in pyramidal neurone.Results：The frequency of trains of action potentials in pyramidal neurone was decreased significant?ly by 300 μmol∕L glycine，this effect could be blocked by 1 μmol∕L strychnine，demonstrating that it acts on strychnine-dependent glycine receptors.The glycine can cause membrane hyperpolariza?tion，prolong the latent period of action potential，accelerate the repolarization process.Conclusion：The glycine receptors in prefrontal cortex may involve in important function in regulation of VTA-NAcc-PFC neural circuit.

glycine；prefrontal cortex；action potential

R338.2-33

A

1673-0143（2012）06-0049-04

（責(zé)任編輯：范建鳳）

2012－09－13

湖北省自然科學(xué)基金重點項目（2008CDA053）；武漢市科技計劃項目（201250499145-27）

劉宇煒（1973—），男，副教授，博士，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)。