兩個蛹蟲草菌株的人工栽培試驗比較

田雪梅

(山東省應(yīng)用真菌重點實驗室 青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東 青島 266109)

蛹蟲草 (Cordycepsmilitaris(Fr.)Link)又名北冬蟲夏草、蛹草、北蟲草、蛹草菌,分類學(xué)上屬于真菌門 (Eumycota),子囊菌亞門 (Ascomycotinia),核菌綱 (Pyrenomycetes),球殼目 (Sphaeriales),麥角菌科 (Clavicip tiaceae),蟲草屬 (Cordyceps),是蟲草菌寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體及幼蟲上形成的蟲菌復(fù)合體[1～2]。

蛹蟲草與冬蟲夏草在生物學(xué)上為同一個屬,有相同或十分相似的化學(xué)成分,而且蛹蟲草的蟲草素、K、Ca、Se、維生素等對人體有益的成分含量高于野生冬蟲夏草。大量的藥理藥化試驗及臨床實踐證明,蛹蟲草與野生冬蟲夏草對人體具有相同或相似的功能。隨著對蟲草認識不斷深化,國內(nèi)以及東南亞、日本、美國等國際的市場需求量都在不斷增加。所以進一步加強對蛹蟲草的全面深入研究是十分必要的[3]。

為比較本研究所保藏的兩個蛹蟲草菌株在栽培、產(chǎn)量及有效成分含量等方面的差異,設(shè)計了以下試驗。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 蛹蟲草1號,蛹蟲草2號,均由山東省應(yīng)用真菌重點實驗室(青島農(nóng)業(yè)大學(xué))提供。

1.2 培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)基A:大米50 g,蠶蛹粉2.5 g,營養(yǎng)液50 mL;培養(yǎng)基B:大米50 g,蠶蛹粉5 g,營養(yǎng)液50 mL。其中兩個配方的營養(yǎng)液配方均為:蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,MgSO40.05%,KH2PO40.1%。

1.3 試驗設(shè)置 分別對供試的4個處理編號為:1A、2A、1B、2B。其中數(shù)字1為蛹蟲草1號,2為蛹蟲草2號。

1.4 試驗方法

(1)培養(yǎng)基制作。選用500 mL罐頭瓶,每瓶裝大米50 g,添加適量蠶蛹粉,再加營養(yǎng)液,輕輕拌勻。用高壓聚丙烯薄膜和皮筋包扎封口,121℃、高壓蒸汽條件下滅菌30 min。

(2)液體菌種的制備。無菌操作,取0.5 cm2斜面母種菌種塊6～7塊,接入裝有200 mL PDA液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中。接種后,置20℃、180 r/min條件下,震蕩培養(yǎng)4天,作為液體菌種備用。

(3)栽培瓶接種。按無菌操作,用移液槍吸取7 mL液體菌種接種到經(jīng)滅菌的栽培瓶中。將接種完畢的栽培瓶置于20℃栽培室中避光培養(yǎng)。

(4)發(fā)菌管理[4～6]。蛹蟲草菌絲生長的適宜溫度為10～25℃,開始的3～4天發(fā)菌室控制在18～20℃,以后將溫度調(diào)整到22～25℃。保持室內(nèi)空氣濕度在65%左右。發(fā)菌前1周可不通風(fēng),中后期適當(dāng)通風(fēng)換氣,以后每兩天或每天通風(fēng)1次,每次30～40 min。菌絲生長階段不需要光線,避光培養(yǎng)。培養(yǎng)19天,菌絲長滿瓶后,繼續(xù)在黑暗條件下培養(yǎng)3～4天,促使菌絲后熟,為后面的出草打好基礎(chǔ)。

(5)轉(zhuǎn)色期管理 (催蕾管理)[7]。將發(fā)滿菌絲的栽培瓶分層排放在架上,進行轉(zhuǎn)色管理。每天早晨8時開始通風(fēng)見光,每天光照時間不少于12 h,光照強度200 lx左右。利用10～20℃晝夜溫差進行連續(xù)溫差刺激,轉(zhuǎn)色期2～8天,等到菌絲全部由白色轉(zhuǎn)為黃色后,每天1～2次于地面噴灑霧狀水,保持濕度85%～95%。料面上會很快形成小米粒狀菌蕾。

(6)生長階段管理[8]?？刂茰囟确秶鸀?9～25℃。初期空氣相對濕度控制在80%左右,待子實體長出1 cm后,將空氣濕度提高到90%。出草期間用噴霧器向地面及墻壁四周噴水以提高濕度。在整個生長過程中,不需要去掉封口薄膜。當(dāng)蛹蟲草長到約1 cm高時,用粗針或竹簽在封口薄膜上扎幾個孔以增加通氣量。此階段主要靠自然散射光照,避免強光直射。

(7)采收。按照上述管理,待蛹蟲草子實體長到長度為5～8 cm時為成熟,去掉封口薄膜,用鑷子將子實體從培養(yǎng)基上摘下或輕輕拔出。

(8)營養(yǎng)成分的測定。蛹蟲草子實體及培養(yǎng)料中總糖含量的測定采用蒽酮硫酸法[9],還原糖測定采用DNS法[10],多糖含量=(總糖-還原糖)×0.9。蟲草酸含量的測定采用比色法[10～11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草生長變化 培養(yǎng)19天左右,白色菌絲體布滿整個培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)3天后見光。見光初期菌絲為白色絨毛狀,長勢健壯,經(jīng)自然光照射,可以產(chǎn)生黃色色素;見光2～8天,菌絲由白色逐漸轉(zhuǎn)為橘黃色或橘紅色。菌絲分泌色素后,培養(yǎng)基表面即出現(xiàn)米粒狀的橘黃色菌蕾。

雛形子實體經(jīng)過15～20天的生長,不斷抽長,頂端稍微膨大呈棍棒形。蟲草膨大部分形成子座,子座周圍產(chǎn)生許多小粒點 (子囊殼頸部和孔口)。這時子座已經(jīng)成熟 (即蟲草成熟),應(yīng)及時采收。

子實體生長密集的地方,其個體的直徑比較小;反之,在生長稀疏的地方,子實體比較粗。蟲草有較強的趨光性,如果出現(xiàn)子實體倒向一邊,應(yīng)調(diào)整室內(nèi)光源方向,或調(diào)整瓶的方向,以保證子實體生長形態(tài)正常。

蛹蟲草1號生長停止后,頂端出現(xiàn)許多小刺,手觸不光滑,頭部出現(xiàn)龜裂狀花紋,表面可見黃色粉末狀物,子實體易斷。而蛹蟲草2號子實體光滑,有韌性,不易折斷,以致區(qū)別。

2.2 子實體 (蟲草)采收和處理 大米培養(yǎng)基栽培的蛹蟲草,見表面有橘黃色粉末狀物質(zhì)出現(xiàn)時表明子實體停止生長,應(yīng)立即采收。采收時,各處理分別取5瓶,將子實體根部整理干凈,及時置于60℃下烘干、稱重,計算各處理的生物轉(zhuǎn)化率(圖1)。

圖1 4個蛹蟲草處理生物轉(zhuǎn)化率測定

從圖1可以看出,蛹蟲草2號菌株的生物轉(zhuǎn)化率顯著高于1號菌株;對同一菌株,A培養(yǎng)基顯著高于B培養(yǎng)基。

2.3 蛹蟲草子實體和培養(yǎng)料中多糖含量的測定蛹蟲草子實體及培養(yǎng)料中多糖含量測定結(jié)果及差異顯著性分析結(jié)果如表1所示。從表1可知,蛹蟲草1號的多糖含量顯著高于蛹蟲草2號。同一菌株,其子實體中的多糖含量一般高于培養(yǎng)料中的多糖含量。相對來說,培養(yǎng)料中的多糖含量也還比較高,可考慮再次出草。

2.4 蛹蟲草子實體及培養(yǎng)料中蟲草酸含量的測定從各處理蛹蟲草菌絲體提取液中蟲草酸的含量及其差異顯著性分析結(jié)果 (表1)可以看出,各處理間均存在極顯著差異,蛹蟲草2號蟲草酸的含量明顯高于蛹蟲草1號;培養(yǎng)料中蟲草酸含量一般低于子實體中的含量,但其含量尚可,仍應(yīng)加以利用,以提高蟲草酸的提取和利用率。而2A子實體中蟲草酸含量則較高,達到7.39%,與其他處理間存在極顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗所得蟲草多糖含量最低為12.21%,最高為22.77%,明顯高于李顏等所測得的蟲草多糖含量9.05%、8.52%、18.0%、 10.03%、11.3%、5.07%[10]。而蟲草酸的含量則明顯低于蔡友華等測得的巴西蟲草菌絲體中蟲草酸的含量8.45%[11],與李顏等所得的不同蛹蟲草中蟲草酸含量 6.58%、4.28%、4.25%、2.39%、5.89%、4.71%[10]相近。

表1 蛹蟲草中多糖含量與蟲草酸含量的測定結(jié)果

由試驗結(jié)果可以看出,在蟲草多糖、蟲草酸含量上,相同的菌株,一般子實體含量高的,其對應(yīng)的培養(yǎng)料中含量也較高。蠶蛹粉的加入量對蟲草其他有效成分的影響還有待于進一步研究。出草后培養(yǎng)料中尚存大量多糖和蟲草酸,可考慮繼續(xù)培養(yǎng)再次出草,亦可直接利用培養(yǎng)料進行有效成分提取。綜合考慮生物轉(zhuǎn)化率、多糖及蟲草酸含量等的試驗數(shù)據(jù),認為2號蛹蟲草菌株與培養(yǎng)基A的組合具有明顯優(yōu)勢,可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

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