小麥麩皮結構層中抗氧化物質的研究

陳中偉，廉文蕾，吳保承，楊春霞，王 莉，3，陳正行，3，*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.江蘇省江大綠康生物工程技術有限公司，江蘇無錫214028;3.糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

大量的流行病學研究表明:增加全谷物食品的攝入能有效降低心腦血管病、II 型糖尿病等慢性病的發(fā)病率，能很好地與果蔬中的抗氧化成分互補，是美國農業(yè)部推薦的人類膳食結構“My plate”中重要的組成部分［1-2］。麥麩是全谷食品的重要的組成，含有豐富的膳食纖維、蛋白質、礦物質和B 族維生素，營養(yǎng)價值很高，是我國重要的農副產(chǎn)品。小麥麩皮由多個結構層構成，可大致分為外皮層、中間層和糊粉層［3］。不同解剖結構中含有的抗氧化成份含量不同，主要包括肉桂酸系物質，如阿魏酸，香豆酸，咖啡酸等;沒食子酸同類物以及阿魏酰類低聚糖類物質［4-5］。其中，部分抗氧化成分不僅可作為分析麥麩粉體中的標示物，用于反映糊粉等產(chǎn)品的純度［6］，而且具有良好的營養(yǎng)生理活性。如果能高效濃縮富集，可以作為小麥深加工增值的一個方向。目前，對小麥麩皮中的生理活性成分提取，主要是堿法和酶法，但由于水解條件和體系中成分的復雜性，很難明確地反映水解效果的好壞。本文旨在比較理想的條件下，通過酶法、堿法水解提取麥麩各生理解剖層中抗氧化活性成分，探明麥麩各生理結構層中抗氧化成分的分布，為后續(xù)分離麥麩產(chǎn)品提供參照和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 濟麥22;阿魏酸標準品、DPPH·、3，4，5-三甲氧基肉桂酸 Sigma 公司;木聚糖酶、纖維素酶 諾維信(中國)生物技術有限公司;福林酚試劑 國藥集團。

UV1800 紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;Agilent 1100 液相測譜儀HPLC 安捷倫;水浴恒溫振蕩器 榮華SHA-BA;5804-R 離心機 德國Eppendorf ;pH 計、萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;0.45μm 有機相微濾膜

上海楚定分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥麩皮解剖層樣品制備 稱取20g 小麥籽粒，用去離子水浸泡約10h，在籽粒濕潤的條件下，用鑷子按從外向內依此剝離得到外皮層、中間層和糊粉層，參照Antoine C 的方法［7］。將小麥麩皮解剖層烘干，研磨，使其顆粒過120 目篩，保藏在含P2O5的干燥皿中備用。

1.2.2 酶法提取抗氧化成分 取小麥麩皮樣品外皮層、中間層、糊粉層各20mg，精確到0.001g，添加10mL 含1%的木聚糖酶和1%纖維素酶的混合酶液，用磷酸緩沖溶液調節(jié)至pH5，55℃條件下，振蕩水解3h［8］，5000r/min 離心20min，取上清液，添加1mg/mL的3，4，5-三甲氧基肉桂酸100μL 至水解液中作為內標物。利用3 倍乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相，減壓濃縮至一定體積，利用氮氣吹干，用0.4mL 50%的甲醇水溶液溶解，并使用0.45μm 有機相過濾膜過濾，密封冷藏供高效液相測定。

1.2.3 堿法水解提取抗氧化成份 精確稱取麥麩各個生理層樣品各20mg，精確到0.001g，添加到10mL的2.0mol/L 的NaOH 溶液中，在氮氣存在的條件下，黑暗中水解2h，添加1mg/mL 的3，4，5-三甲氧基肉桂酸100μL 至溶液中作為內標物，利用6μmol/L 鹽酸中和至pH =2，利用3 倍體積的乙酸乙酯提取兩次，將提取液合并，濃縮，并用氮氣吹干，0.4mL 的50%的甲醇溶液溶解，過有機相過濾器過濾，液相測定酚酸含量［6］。

1.2.4 總酚的測定及抗氧化能力測定 將100μL 提取物混入500μL 福林酚試劑，利用1.5mL 的20%碳酸鈉中和。反應2h 后，在765nm 波長下測定溶液的吸光度值，重復三次，取平均值。同樣的條件下，測定沒食子酸與福林酚試劑的混合液的吸光度值，制作標準曲線，總酚含量用(μmol GAE/g)來表示［9］。

取0.1mmol/L 的DPPH·溶液與提取液各2mL，振蕩混勻后，置于室溫下避光反應40min，然后在517nm 處測吸光值，重復3 次，取平均值［10］。

式中:Ai-平行組的吸光值;A0-空白組的吸光值;P-清除率(%)。

1.2.5 酚酸含量液相測定 液相條件:反相柱C18柱(5mm，250mm ×4.6mm);檢測器為紫外檢測器;波長320.8nm;流動相:(A)乙腈;(B)pH4.6 的醋酸鹽緩沖溶液;進樣速率0.8mL/min;柱溫35℃;線性比例0～24min，A/B 從15∶85 至35∶65;24～24.5min，從35∶65至60∶40;24.5～29min，從60∶40 至15∶85;29～34min，保持15∶85 的比例5min［11］。

2 結果與討論

2.1 小麥麩皮生理層比例

對于不同小麥品種，麩皮中的生理結構組成不同。對于本實驗中的樣品，從20g 小麥籽粒上剝離得到外皮層、中間層和糊粉層的質量分別為:0.54、0.51、1.03g。比例為1.06∶1∶2.02(見表1)，該比例與Hemery 等解剖杜倫麥得到的外皮層、中間層和糊粉層的比例相近［12］。結果如圖1 所示，外皮層和中間層主要是由纖維狀的細胞組成，糊粉層為厚約50μm的細胞，由細胞壁包裹的兩類顆粒組成，不同的組成結構可能使得提取物中的酚酸的成分有所差異［7］。

圖1 小麥麩皮解剖層的結構Fig.1 Structer of different layers in wheat bran

表1 小麥麩皮解剖層分析Table 1 Proportion of three layers in wheat bran

2.2 酶法和堿法對麥麩生理層中酚酸提取效果

麥麩的細胞壁主要是由戊聚糖組成，其中阿拉伯木聚糖占其比例的60%～70%［13］。麥麩細胞壁中含有羥基肉桂酸類化合物，如阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸等。由液相測定酚酸的結果(表2)中可以看出，堿解后，糊粉層中單體阿魏酸含量為5.90mg/g，明顯高于中間層和外皮層，而外皮層中的阿魏酰聚體的含量最高，為4.34mg/g，是糊粉層中含量的4.6 倍。這主要是由于在小麥麩皮中，組成各個結構層的糖的比例不同。在外皮層中，阿拉伯糖與木糖的比例是糊粉層中比例的三倍［7］。同時，木糖主鏈之間通過阿魏酰阿拉伯糖結合體相互交聯(lián)。在糊粉層中，阿魏酸主要以單體形式存在，同時，p-香豆酸在糊粉層中的含量最高，分別是外皮層和中間層中含量的6倍和3 倍，可以做為糊粉層從麥麩中分離程度的判定參照物質。Antoine C 和Hemery 等［6，12］利用堿法提取硬麥(T.aestivum L)皮層中的阿魏酸類物質，在外皮層中阿魏酸脫氫三聚體的含量明顯高于其他的生理結構層，可以做計算麩皮層中外皮層比例的生化標示物;而在糊粉層中，單體阿魏酸和p-香豆酸的含量明顯高于其它層。

表2 酶法和堿法水解麥麩解剖層的酚酸含量Table 2 Phenolic acid contents of hand isolated parts of wheat grain after alkaline hydrolysis and enzymolysis

利用木聚糖和纖維素酶混合酶液水解后，與堿解后的水解液相比，阿魏酸在外皮層、中間層和糊粉層中釋放提取率分別為46.9%、51.0%、56.3%;對阿魏酸脫氫聚體的提取效率為71.0%、52.6%、51.1%?；旌厦笇蹖雍椭虚g層中酚酸物質的提取效率較外皮層的高，這可能是由于外皮層的疏水性造成的。外皮層在小麥外皮中起保護胚乳和胚芽的作用，具有較強的疏水性，這可能使得木聚糖酶和纖維素酶與底物的接觸受到限制，而糊粉層的細胞壁的可溶性膳食纖維含量高，其內容物中也含豐富的蛋白質和粉狀顆粒［14］，具有較強的吸水性，利于酶的接觸，從而造成酶解效率的差異。同時，阿魏酸和香豆酸在糊粉層中含量較外皮層中含量高，相同底物濃度的條件下，與底物的接觸機率較大，利于酚酸釋放。

2.3 總酚含量

從圖2 中可以看出，堿水解后，糊粉層的總酚含量最高，為53.1μmol GAE/g，總酚含量從高到低的順序依次為:糊粉層、外皮層、中間層。酶解后，糊粉層中的總酚含量為28.5μmol GAE/g。由圖1 中的趨勢可以看出，酶解后，總酚的含量相對堿解后下降?？傮w上，酶解后與堿解后總酚含量之比，與兩種工藝條件下的酚酸提取率相近。酶解和堿解后提取液中的總酚含量比為:58.9∶100、51.8∶100、53.7 ∶100。Anson N M 等［15］研究了布勒公司生產(chǎn)糊粉產(chǎn)品的抗氧化性，表明經(jīng)堿水解、離心除去蛋白后，總酚含量達50μmol GAE/g。

圖2 麥麩結構層酶解和堿解后總酚含量Fig.2 Total phenols content of wheat bran layers after enzymatic and alkaline hydrolysis

2.4 提取物的抗氧化能力

由圖3 中可以看出，經(jīng)過堿水解后，外皮層的抗氧化能力最大，E50為4.3mg/mL，其次為糊粉層，E50為7.5mg/mL。即小麥麩皮各層的清除自由基能力的強弱順序依次為:外皮層，糊粉層和中間層。經(jīng)過酶水解后，各組分的提取物的E50都有所增加，但總體的趨勢不變，說明水解對外皮層、糊粉層和中間層中抗氧化成分的水解效果差異不明顯。堿解和酶解的清除自由基能力的差別同樣和酚酸的釋放程度有關。研究表明，阿魏酰低聚糖的清除自由基的能力較游離的阿魏酸高，堿解能夠破壞木聚糖糖苷鍵，釋放出阿魏酰低聚糖［16］。這是造成外皮層E50低于糊粉層的原因，同時在糊粉層中約含有50%的細胞內容物，而起抗氧化作用的主要成分—酚酸，存在于糊粉細胞壁中，這也造成了糊粉層的抗氧化能力下降［17］。

圖3 麥麩解剖層提取物的抗氧能力Fig.3 Antioxidant capacity of wheat bran layers extract

3 結論

總之，通過比較堿解和酶解兩種方式對小麥麩皮各解剖層中的酚酸含量釋放效果的影響，結果顯示，小麥麩皮各個生理層中酚酸的成分和含量有很大差別，經(jīng)堿解后，在外皮層中，阿魏酰脫氫聚體的含量最高，達4.34mg/g;而在糊粉層中阿魏酸單體的含量最高，達5.90mg/g。由于強堿能夠破壞酚酸類物質與多糖連接的酯鍵，釋放出阿魏酸及阿魏酸聚體;而木聚糖和葡聚糖酶只能少量的水解糖苷鍵。因此，在理想條件下，堿解對酚酸的釋放量較酶解更加充分?？梢宰鳛樵u價水解效果的參考標準。同時，提取物中總酚含量和清除自由基能力與多酚含量的釋放率直接相關。

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