對(duì)堿性磷酸酶試劑盒特征吸收峰的分析

何樂春 重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心 （重慶 401147）

0.前言

堿性磷酸酶（ALP）廣泛分布于人體各臟器官中，主要存在于肝臟、骨骼成骨細(xì)胞、胎盤、腎臟、腸壁等。其中以肝臟為最多，其次為腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼。生長期兒童血清內(nèi)的大多數(shù)來自成骨細(xì)胞和生長中的骨軟骨細(xì)胞，少量來自肝。ALP也是目前免疫診斷試劑產(chǎn)品最常用的標(biāo)記酶之一，臨床上測(cè)定ALP主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸的鑒別診斷。對(duì)于不明原因的高ALP血清水平，可測(cè)定同工酶以協(xié)助明確其器官來源。ALP測(cè)定試劑盒則用于體外定量檢測(cè)人血清或血漿中堿性磷酸酶的活性，在臨床上作輔助診斷用。

1.試驗(yàn)過程

1.1 堿性磷酸酶試劑盒說明

試劑盒里試劑為雙試劑，即分別由R1（緩沖液，主要成分為2-氨基-2-甲基-1-丙醇）、R2（底物，主要成分為對(duì)硝基苯磷酸鹽）組成。

1.2 試驗(yàn)原理

對(duì)硝基磷酸鹽在PH10.4且有鎂離子存在的環(huán)境下，可以被ALP水解成p-NP，p-NP在405nm處有特異性吸收，且由p-NP引起的吸光度上升的速率與ALP的活力成正比。

（1）試驗(yàn)依據(jù)：采用企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)《堿性磷酸酶試劑盒》中對(duì)“試劑空白吸光度”的試驗(yàn)方法，同時(shí)結(jié)合產(chǎn)品說明書進(jìn)行試驗(yàn)。

試劑空白吸光度：將R1試劑與R2試劑以5:1混合配制成應(yīng)用試劑，用蒸餾水調(diào)整分光光度儀的零點(diǎn)后，測(cè)定試劑在波長405nm、1cm比色池、37℃條件下穩(wěn)定30s后的吸光度，測(cè)定3次，取其平均值作為應(yīng)用試劑的空白吸光度，吸光度值應(yīng)≤0.6。

（2）試驗(yàn)試劑：嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書中對(duì)ALP的檢驗(yàn)方法要求，即R1:R2:質(zhì)控血＝25:5:1配制成試驗(yàn)試劑。

（3）試驗(yàn)儀器：半自動(dòng)生化分析儀（Secomam Basic）、全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S-800）、紫外分光光度儀（TU-1901）。

（4）試驗(yàn)步驟。

（a）用半/全自動(dòng)生化分析儀和紫外分光光度儀分別連續(xù)3次檢測(cè)應(yīng)用試劑空白吸光度（檢測(cè)波長為405nm、412nm、415nm）；

（b）用紫外分光光度儀對(duì)應(yīng)用試劑進(jìn)行掃描（以蒸餾水調(diào)整分光光度儀零點(diǎn)）；

（c）用紫外分光光度儀對(duì)試驗(yàn)試劑進(jìn)行掃描，檢出特征吸收峰（以應(yīng)用試劑調(diào)整分光光度儀零點(diǎn)）。

2.試驗(yàn)結(jié)果

（1）用不同儀器檢測(cè)得出試劑空白吸光度的值（見表1）。

（2）以蒸餾水調(diào)零，得出應(yīng)用試劑的光譜圖（見圖1）。

（3）以應(yīng)用試劑調(diào)零，得出試驗(yàn)試劑光譜圖，檢出特征吸收峰（見圖2）。

表1.

圖1.

圖2.

3.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析

3.1 企業(yè)的產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中要求試劑空白吸光度應(yīng)≤0.6，從表1中數(shù)據(jù)得出：第一，在測(cè)定波長為405nm時(shí)，用半自動(dòng)生化分析儀和紫外分光光度儀所測(cè)得吸光度均大于0.6，不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且兩臺(tái)儀器所測(cè)得的值有一定差異，差值近0.1。

3.2 從圖1可看出，以蒸餾水調(diào)零后，應(yīng)用試劑的吸光度在400nm～450nm波長范圍呈下降趨勢(shì)，其下降趨勢(shì)與表1中用不同儀器分別在412nm、415nm這兩個(gè)波長所測(cè)得的具體數(shù)據(jù)相吻合。

3.3 從圖2得出，試驗(yàn)試劑的特征吸收峰為415nm，與試驗(yàn)原理中所提及到的“p-NP在405nm處有特異性吸收”不相吻合。

4.結(jié)束語

ALP試劑盒的試驗(yàn)原理為ALP將硝基磷酸鹽水解成對(duì)硝基酚（p-NP），即是以最終反應(yīng)生成物p-NP吸光度的變化率來檢測(cè)出ALP的活力。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：不同的酸堿度對(duì)p-NP的呈色反應(yīng)有影響，酸性時(shí)P-NP最大吸收峰為295～340nm；堿性時(shí)P-NP最大吸收峰為375～420nm。該廠家生產(chǎn)的試劑盒的試驗(yàn)原理中特別注解試驗(yàn)環(huán)境“在PH10.4”（即為堿性環(huán)境），特征吸收峰為405nm，與試驗(yàn)所得特征吸收峰為415nm雖都在文獻(xiàn)報(bào)道的吸收峰范圍內(nèi)，但兩個(gè)吸收峰相差10nm。查閱目前市場(chǎng)上幾大廠家生產(chǎn)的堿性磷酸酶試劑盒（試驗(yàn)原理相同）的說明書，說明書上皆標(biāo)注在405nm處有特征吸收峰，這與紫外分光光度儀的特性不相吻合（注：從紫外分光光度儀的特性來講，任一物質(zhì)通過儀器掃描所得的特征吸收峰和理論吸收峰之差都應(yīng)在±2nm內(nèi)）。

在此，筆者對(duì)該廠家企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)空白吸光度的要求（≤0.6）理解是：第一，注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)沒有根據(jù)空白吸光度的具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果來制定，標(biāo)準(zhǔn)的可行性不強(qiáng)；第二，按照試驗(yàn)的平行操作原理，如空白吸光度是在415nm處檢測(cè)，做準(zhǔn)確性這一項(xiàng)目時(shí)，所得準(zhǔn)確性的結(jié)果也應(yīng)是在415nm處測(cè)得，這與標(biāo)準(zhǔn)中要求的檢測(cè)波長405nm不相吻合，即標(biāo)準(zhǔn)的制定缺乏可操作性；第三，目前不論是全自動(dòng)生化分析儀還是半自動(dòng)生化分析儀，其檢測(cè)波長都為固有化，即只有相應(yīng)的幾個(gè)波長可供選擇，如半自動(dòng)生化分析儀（Secomam Basic）的檢測(cè)波長只有8個(gè)，全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S-800）的檢測(cè)波長只有12個(gè)。企業(yè)在制定產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)及試驗(yàn)方法時(shí)只能選擇與真實(shí)特征吸收峰相隔最近的波長為檢測(cè)波長，或許由此原因，讓企業(yè)在擬定產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)會(huì)考慮到相關(guān)問題，從而使得產(chǎn)品的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)有一定的缺陷。但不論是何原因，產(chǎn)品的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與產(chǎn)品的出廠檢驗(yàn)結(jié)果相一致，即應(yīng)通過具體的試驗(yàn)來驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的可行性和可操作性，且企業(yè)也應(yīng)通過出廠檢驗(yàn)的結(jié)果來嚴(yán)格把握好產(chǎn)品的質(zhì)量關(guān)。

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