凍融法提取脾臟轉(zhuǎn)移因子影響因素的試驗(yàn)

劉 堯，劉宗柱

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer factor，TF）是免疫活性淋巴細(xì)胞所釋放的參與機(jī)體免疫功能的多肽與寡聚核苷酸的混合物，可以將供體的免疫特性轉(zhuǎn)移給受體的淋巴細(xì)胞，從而提高機(jī)體免疫功能。獸醫(yī)臨床常用以提高機(jī)體免疫機(jī)能以及解除免疫抑制［1-2］。TF提高機(jī)體免疫力的作用無(wú)種屬特異性，可以在不同種屬的動(dòng)物之間相互轉(zhuǎn)移免疫信息。隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖中免疫抑制性疾病的多發(fā)，TF相關(guān)制劑的應(yīng)用愈發(fā)具有重要的臨床意義。目前，制備TF的原料較多應(yīng)用的是豬、肉雞等動(dòng)物的脾臟，制備工藝多采用反復(fù)凍融、高壓均質(zhì)、離心、透析或超濾等工藝，但目前對(duì)轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響因素方面的研究很少報(bào)道。本試驗(yàn)以豬脾臟為試驗(yàn)原料，主要研究了凍融次數(shù)、透析時(shí)間及勻漿介質(zhì)對(duì)豬脾臟轉(zhuǎn)移因子中多肽及核酸含量的影響，以期為豬脾臟TF制備工藝的優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

商品豬新鮮脾臟（購(gòu)自金鑼食品集團(tuán)公司屠宰場(chǎng)）；UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；透析袋（21mm，USA進(jìn)口）；絞肉機(jī)；組織勻漿機(jī)。

1.1 試驗(yàn)材料及預(yù)處理 豬脾臟購(gòu)自山東金鑼食品集團(tuán)公司屠宰場(chǎng)，-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)將豬脾臟去筋膜、脂肪，剪碎，等分為不同勻漿介質(zhì)的兩組，其中一組按組織濕重1∶1的比例加入生理鹽水，另一組按組織濕重1∶1的比例加入去離子水，分別置絞肉機(jī)中攪碎，轉(zhuǎn)移到組織搗碎機(jī)中勻漿，備用。

不同勻漿介質(zhì)處理后的脾臟勻漿分別裝于數(shù)支5mL聚乙烯離心管中，分別設(shè)置凍融4、6、8、10、12次；凍融結(jié)束后置于離心機(jī)中于4000r／min離心20min，取上清液4mL轉(zhuǎn)入透析袋中，置于2倍體積的緩沖液中分別透析0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h。透析結(jié)束后取透析液于4℃保存待測(cè)。

1.2 透析液中轉(zhuǎn)移因子多肽與核酸濃度測(cè)定 透析液中多肽含量用Lowery（福林酚）法測(cè)定；核酸用苔黑酚法測(cè)定；每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行樣，各點(diǎn)的數(shù)值為平行樣的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 透析不同時(shí)間點(diǎn)多肽及核酸的濃度數(shù)值以平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS軟件檢驗(yàn)其差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 勻漿介質(zhì)及凍融次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響 通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)，初步確定了透析時(shí)間為24h時(shí)透析液中多肽及核酸基本達(dá)到透析平衡。對(duì)不同勻漿介質(zhì)和凍融次數(shù)處理后，測(cè)定上清液透析24h時(shí)透析液中多肽濃度、核酸濃度的變化如圖1、2所示。

反復(fù)凍融6次時(shí)，透析液中多肽的濃度最高，凍融次數(shù)超過(guò)8次，透析液中多肽濃度反而有降低的趨勢(shì)。原因可能在于凍融次數(shù)過(guò)多使細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶釋放較多，從而使多肽等活性成分降解的比例增加。不同凍融次數(shù)下以去離子水為勻漿介質(zhì)的多肽收率均略高于生理鹽水，說(shuō)明以去離子水為勻漿介質(zhì)破碎細(xì)胞的效果較好。

透析液中核酸的變化趨勢(shì)與多肽濃度的變化基本一致（圖2）。以去離子水為勻漿介質(zhì)，反復(fù)凍融4、6、8、10次和12次時(shí)，透析出的核酸濃度比生理鹽水更高，說(shuō)明去離子水為勻漿介質(zhì)在反復(fù)凍融過(guò)程中對(duì)細(xì)胞膜的破壞更有助于核酸的釋放。

2.2 透析時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)移因子提取率的影響 通過(guò)對(duì)凍融次數(shù)和勻漿液的試驗(yàn)為基礎(chǔ)，我們選定用去離子水勻漿，勻漿液凍融6次，對(duì)多肽以及核酸透析達(dá)到平衡的時(shí)間進(jìn)行研究。結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著透析時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)移因子中多肽的含量不斷增加，在透析24h的時(shí)候基本趨向平穩(wěn)，雖然在48h的時(shí)候達(dá)到了高峰，但與透析24h相比，其升高的幅度并不大，因而從生產(chǎn)效率的角度考慮，對(duì)于多肽的收率，透析24h就已足夠。

在12h前，核酸的含量隨著透析時(shí)間的增加穩(wěn)步快速上升，12h以后上升的速度開(kāi)始下降，直到24h時(shí)達(dá)到峰值，此后核酸的含量開(kāi)始下降。

3 討論

轉(zhuǎn)移因子因其獨(dú)特的作用特點(diǎn)在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但對(duì)于轉(zhuǎn)移因子制備技術(shù)方面的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。鄧夕軍等研究了在勻漿液中加入檸檬酸鈉作為凝絮劑，可以加快反復(fù)凍融后離心分離上清液的速度，并比較了超濾法和透析法的分離效率，但對(duì)于反復(fù)凍融次數(shù)、勻漿介質(zhì)以及透析的合適時(shí)間等因素沒(méi)有涉及［3］。

利用豬脾臟提取轉(zhuǎn)移因子的關(guān)鍵步驟是破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的多肽及核酸充分釋放出來(lái)。反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞的基本原理在于，當(dāng)組織勻漿處于冰點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分形成冰晶結(jié)構(gòu)，冰晶體積的膨脹導(dǎo)致細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)被破壞。伴隨著這一過(guò)程，細(xì)胞局部的脫水、pH值的變化等，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化。不同的勻漿介質(zhì)會(huì)影響冰晶形成的過(guò)程以及細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓梯度的大小，從而影響凍融時(shí)細(xì)胞的破碎效果。目前所報(bào)道的轉(zhuǎn)移因子制備方法中，勻漿介質(zhì)有的采用去離子水，有的采用生理鹽水，但采用不同的勻漿介質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用去離子水的效果要明顯好于用生理鹽水，這是因?yàn)橛萌ルx子水時(shí)脾臟細(xì)胞的內(nèi)外滲透壓要大于用生理鹽水時(shí)的滲透壓，更容易使細(xì)胞破碎，讓細(xì)胞內(nèi)容物更容易釋放出來(lái)。

反復(fù)凍融結(jié)合高壓均質(zhì)或超聲破碎細(xì)胞，仍是目前轉(zhuǎn)移因子規(guī)?；a(chǎn)的常規(guī)方法。生產(chǎn)過(guò)程中的反復(fù)冷凍是一個(gè)相對(duì)耗能、耗時(shí)的環(huán)節(jié)，也是影響轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)成本的重要因素。目前報(bào)道的方法中反復(fù)凍融的次數(shù)在3～10次不等［4-5］，我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，反復(fù)凍融6次以上，多肽及核酸的透析濃度并沒(méi)有顯著增加。說(shuō)明脾臟細(xì)胞經(jīng)過(guò)6次反復(fù)凍融已基本破碎完全，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際選擇凍融次數(shù)4～6次是比較合適的，太多的反復(fù)凍融沒(méi)有什么意義，反而增加生產(chǎn)成本。

多肽的透析到24h的時(shí)候趨向穩(wěn)定，雖然此后還緩慢增長(zhǎng)，但是增長(zhǎng)并不顯著，而核酸在12h以前含量急速上升，在12h到24h比較平穩(wěn)且緩慢地上升，這是由透析的原理決定的，即當(dāng)透析內(nèi)外液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)透析就宣告結(jié)束，繼續(xù)透析已無(wú)實(shí)際價(jià)值。提高透析效率的簡(jiǎn)單有效措施是多次透析，因此在條件允許的情況下，實(shí)施多段分次透析，透析外液使用去離子水，提高濃度差，從而提高轉(zhuǎn)移因子的收率。另外，采用中空纖維超濾法制備轉(zhuǎn)移因子，具有提取效率高、生產(chǎn)功效高的特點(diǎn)［4］，是值得推廣的規(guī)?；a(chǎn)方法。

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［4］閆肅，楊琳，申鎮(zhèn)維，等.轉(zhuǎn)移因子口服液制備方法的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2007，6（6）：355-356.

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