金絲桃素粉劑對人工感染傳染性囊病病毒雞的療效試驗(yàn)

尚若鋒，劉 宇，陳炅然，郭文柱，郭志廷，梁劍平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050）

雞傳染性囊?。↖BD）是由雞傳染性囊病病毒（IBDV）引起的是一種免疫抑制性、急性和高度接觸性的傳染病。該病毒主要侵害4～6周齡雞的腔上囊，破壞其中正在分化成熟的B淋巴細(xì)胞，使病雞更易感染新城疫、馬立克病和傳染性支氣管炎等疾病，從而引起雞的急性發(fā)病甚至死亡。最初由IBD引起的雞死亡率較低，目前由于病毒的變異，某些強(qiáng)毒株可使感染雛雞的發(fā)病和死亡率都高達(dá)100%，因此本病己成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一［1］。

金絲桃素（Hypericin）是從貫葉連翹中提取的一種極具抗病毒的活性成分［2］。金絲桃素在抗腫瘤和抗病毒的方面研究比較活躍，尤其對人體免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）有明顯的抑制作用［3］。最近的研究表明，金絲桃素對多種畜禽病毒也具有良好的抑制效果，可降低畜禽因病毒性疾病而引起的死亡率［4］。本試驗(yàn)旨在研究金絲桃素粉劑對人工感染引起的傳染性囊病的治療效果，從而為研制新型抗病毒藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 金絲桃素粉劑，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供，由貫葉連翹經(jīng)過一定的工藝提取加工而成，其中金絲桃素含量為0.3%。高免卵黃抗體，由洛陽普萊柯生物工程有限公司生產(chǎn)（批號：080324）。

1.2 試驗(yàn)毒株 傳染性囊病病毒毒株為標(biāo)準(zhǔn)毒株（IBDV BC-6／85），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。該毒株BID50為10-5.0／0.1mL，使用時稀釋到100BID50／0.1 mL，并加入～I(xiàn)U／mL的青霉素和5120μg／mL鏈霉素，在-70℃保存待用。

1.3 試驗(yàn)動物和雞胚 20日齡海藍(lán)褐健康雛雞，共180只，雌雄各半，購自河北高碑店市種雞場。在10日齡和15日齡時分別用腔上囊抗體試劑盒檢測抗體，剔除抗原陽性者或體弱者。10日齡的SPF雞胚，共60枚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)分組及病毒感染 將180只雞隨機(jī)分為6組，每組30只。分別為金絲桃素粉劑高、中、低劑量組、高免卵黃抗體對照組、陽性對照組和陰性對照組。除陰性組外，每只雞均通過點(diǎn)眼感染0.1mL的病毒稀釋液。在攻毒前和試驗(yàn)結(jié)束后，稱重每一組的所有雞只，計算每組的相對增重率。在試驗(yàn)期間，每天觀察各組雞的精神狀態(tài)、臨床表現(xiàn)及其死亡情況等，計算發(fā)病率和死亡率。以上各組雞均飼養(yǎng)在不同的隔離器中，飼喂不添加任何藥物和添加劑的飼料，自由飲水。

1.5 給藥劑量及途徑 在攻毒48h后，根據(jù)金絲桃素粉劑高、中、低劑量組雞群的重量，將金絲桃素粉劑混入飼料中，并采取一定的措施盡量使所有的雞只均能采食到混入藥物的飼料，劑量分別為1330 mg、667.9mg、333.9mg／kg體重·d。每天集中給藥1次，共給藥4d。藥物對照組根據(jù)高免卵黃抗體使用說明書注射給藥，劑量為0.5mL／只，間隔1d，共注射2次。陽性對照組和陰性對照組不給任何藥物。

1.6 病理剖檢觀察 試驗(yàn)結(jié)束后，對存活的各試驗(yàn)雞只實(shí)施安樂死法處死，剖檢后觀察腔上囊、肌肉組織（腿肌和胸肌）和腎臟等的病理學(xué)變化，并按照觀察指標(biāo)進(jìn)行記分［5］。腔上囊病變指數(shù)=腔上囊出血記分總和／雞總數(shù)。記分標(biāo)準(zhǔn)：腔上囊嚴(yán)重出血記4分，中度出血記3分，輕度記1分，黏膜局灶性發(fā)紅0.2分。肌肉病變指數(shù)=肌肉出血記分總和／雞總數(shù)。記分標(biāo)準(zhǔn)：選擇腿肌或胸肌中出血最嚴(yán)重者進(jìn)行打分，嚴(yán)重出血3分／側(cè)，中度出血2分／側(cè)，輕度出血1分／側(cè)。綜合病變指數(shù)=腔上囊出血記分總和+肌肉出血記分總和／雞總數(shù)。

1.7 腔上囊組織中病原分離 試驗(yàn)結(jié)束后，無菌采取各組雞的腔上囊，反復(fù)凍融3次，磨碎后加滅菌生理鹽水作1∶5～1∶10懸液，3000r／min離心10 min，取上清液加入抗生素作用1h。經(jīng)絨毛尿囊膜接種SPF雞胚，每枚接種0.2mL，每組10枚，37℃孵育3～5d，觀察和記錄各組雞胚的病變和死亡情況［6］。

1.8 數(shù)據(jù)處理 采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各試驗(yàn)組之間的差異采用鄧肯多重比較分析法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)雞群臨床癥狀與體重變化情況 攻毒后，陽性組大部分雞出現(xiàn)了典型的傳染性囊病癥狀，如厭食、精神沉郁，個別雞排出白色或黃色水樣糞便等。藥物組和高免卵黃抗體組中部分雞出現(xiàn)程度不同的輕微癥狀。但均未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。

在試驗(yàn)前后，分別對每組雞只進(jìn)行稱重，平均體重見表1。陰性對照組、金絲桃素粉劑中劑量組和陽性對照組之間在試驗(yàn)結(jié)束后體重有極顯著性差異（P＜0.01），金絲桃素粉劑高劑量組、高免卵黃抗體對照組、低劑量組和陽性對照組之間在試驗(yàn)結(jié)束后體重不存在顯著差異。

表1 人工感染試驗(yàn)雞體重的變化情況

2.2 口服金絲桃素粉劑對感染雞群病理變化的影響 試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)每只雞的腔上囊、肌肉（腿肌和胸肌）出血嚴(yán)重程度對其記分后并計算綜合病變指數(shù)，結(jié)果見表2。陽性對照組的綜合病變指數(shù)極顯著高于其他任何各組（P＜0.01）。低劑量組的綜合病變指數(shù)顯著高于（P＜0.05）高免卵黃抗體對照組。高、中劑量組均極明顯低于高免卵黃抗體對照組（P＜0.01）。

2.3 感染雞群傳染性囊病病毒分離結(jié)果 將處理后的腔上囊組織液經(jīng)接種SPF雞胚，孵育3～5d后，各組的雞胚死亡率見表3。陽性對照組的雞胚是100%的死亡，明顯高于其他各組，并出現(xiàn)典型的傳染性囊病病毒增殖特點(diǎn)。

表2 人工感染傳染性囊病病毒后主要臟器的出血病變指數(shù)

表3 人工感染后傳染性囊病病毒分離結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)中，人工感染傳染性囊病病毒后，未出現(xiàn)任何雞的死亡，但可以造成雞典型的腔上囊、肌肉和脾臟的出血，以及花斑腎等癥狀。因此，可以使用病變指數(shù)和病原分離，結(jié)合臨床體重變化，評價藥物對該毒株是否具有一定的抑制作用。

金絲桃素具有明顯的抗RNA病毒的作用，已試用于艾滋病、肝炎病毒和水痘病毒等感染的治療中［2］。在病毒復(fù)制過程中，金絲桃素不影響病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而是干擾病毒的裝配與釋放，另外，金絲桃素還能促進(jìn)機(jī)體的免疫功能［4］。金絲桃素粉劑對傳染性囊病的治療作用除了能夠直接抑制病毒增殖外，可能與提高雞的免疫功能也有一定的關(guān)系，但具體作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

連續(xù)口服高劑量的金絲桃素粉劑后，感染雞群的體重相對于中劑量組稍有下降，但差異不顯著，這可能與金絲桃素粉劑的苦澀味道有關(guān)，影響了雞只獲得擬定的高劑量藥物，從而使得高劑量組的綜合病變指數(shù)稍低于中劑量組。中劑量組的雞群體重顯著藥物對照組和低劑量組（P＜0.01），綜合病變指數(shù)極顯著低于低劑量組和藥物對照組（P＜0.01），另外根據(jù)病毒分離結(jié)果分析，中劑量組能有效抑制病毒的增殖。綜上所述，金絲桃素粉劑具有一定的治療由人工感染引起的傳染性囊病的效果，尤其是以667.9mg／kg體重·d（相當(dāng)于金絲桃素純品2.0 mg／kg體重），連續(xù)口服4d治療效果較好。

［1］周繼勇，李建榮.傳染性法氏囊病病毒變異株弱毒的遺傳穩(wěn)定性與免疫原性［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20（4）：317-320.

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［5］卡爾尼克 B W.禽病學(xué)［M］.高福，劉文軍，譯.9版.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991：427-432.

［6］朱連勤，朱風(fēng)華，張宗敏，等.中草藥制劑對雞人工感染IBD的防治效果的研究［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2002，109（4）：2-4.