RP-HPLC法測定人全血中環(huán)孢素的濃度

宋和梅（連云港市第一人民醫(yī)院藥學部，江蘇連云港 222002）

環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CsA）具有強大的免疫抑制作用，主要用于器官移植術(shù)后的抗排異治療和預防，由于其治療窗狹窄、藥動學個體差異大，臨床應用需要對其實施治療藥物監(jiān)測，優(yōu)化給藥方案，減少其毒副反應的發(fā)生，提高移植的成功率。當前，監(jiān)測CsA血藥濃度的分析方法主要是免疫分析（IA）法和高效液相色譜（HPLC）法。IA法主要包括熒光偏振免疫（FPIA）法、酶放大免疫分析（EMIT）法和放射免疫分析（RIA）法。RIA法因放射性污染、特異性較差已少用；FPIA法由于操作簡便、快捷被臨床廣泛使用，近期因試劑供應問題國內(nèi)已停止使用；與此同時，EMIT法得到了快速推廣，但EMIT法試驗條件苛刻，試劑的穩(wěn)定性和重復性不及FPIA法。本試驗建立了快速、靈敏、準確、實用的全血CsA濃度HPLC分析方法，以滿足CsA治療藥物監(jiān)測的需要。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀，包括600E四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱、996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站、Empower System Suitability軟件（美國Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國密里博公司）；AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；MS2振蕩器（德國IKA公司）；干熱式樣品濃縮器（美國Pierce公司）；TDL80-2B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；溶劑過濾器（天津市威儀科技發(fā)展有限公司）；HP-01無油真空泵（天津市鑫洲科技有限公司）。

1.2 試藥

CsA（純度：99%）、環(huán)孢素D（CsD）（內(nèi)標，純度：95%）均為福建微生物研究所提供；甲醇、乙腈為色譜純，乙醚（使用前重蒸）、氫氧化鈉、鹽酸、正己烷為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Nova-pak C1（8150 mm×3.9 mm，4 μm）；流動相：乙腈-甲醇-水（30.8∶51.2∶18）；流速：1 mL·min－1；柱溫：55℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；內(nèi)標：CsD。在該色譜條件下，CsA、CsD保留時間分別約為4.5、5.6 min，CsA理論板數(shù)＞1028，對稱因子為1.032，容量因子為3.538，與CsD分離良好，分離度（Rs）為1.507，無雜峰干擾。高效液相色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.標準血樣；B.空白血樣；C.患者血樣；1.CsA；2.CsDFig 1 HPLC chromatogramA.standard blood sample；B.blank blood sample；C.blood sample of patients；1.CsA；2.CsD

2.2 溶液的配制

2.2.1 流動相的配制：按30.8∶51.2∶18體積比例分別量取乙腈、甲醇、超純水適量，混勻，用0.45 μm孔徑的濾膜真空抽濾，得上述比例的乙腈-甲醇-水流動相，使用前超聲脫氣10 min備用。

2.2.2 工作溶液：快速稱取氫氧化鈉1.0 g置于1 000 mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.025 mo1·L－1的氫氧化鈉溶液備用。另精密量取36.5%的濃鹽酸2.5 mL置于1 000 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，配成濃度為0.025 mo1·L－1的鹽酸溶液備用。

2.2.3 標準溶液：準確稱取CsA1.94 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密吸取2 mL于50 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為3.1 μg·mL－1的標準溶液使用，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 內(nèi)標溶液：準確稱取CsD 10.54 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密吸取5 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為21 μg·mL－1的內(nèi)標溶液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 標準含藥全血：分別精密吸取CsA標準溶液50、100、200、400、800、1 500 μL，吹干，加空白全血3.0 mL，配成濃度為51.67、103.33、206.67、413.33、826.67、1 550.00 ng·mL－1的含藥全血。

2.3 血樣采集

79例移植患者，行CsA谷濃度（c0）或峰濃度（c2）常規(guī)監(jiān)測。c0于清晨服藥前半小時內(nèi)、c2于清晨服藥后（120±15）min內(nèi)采靜脈血4 mL于肝素抗凝試管中，供CsA血藥濃度測定使用。

2.4 樣品處理

取含藥全血3.0 mL，加CsD內(nèi)標溶液100 μL、0.025 mol·L－1氫氧化鈉溶液3.0 mL，混勻，用乙醚萃取3次（4、3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）4 min，合并乙醚萃取液，吹干；殘渣加甲醇、0.025 mol·L－1鹽酸溶液各1.0 mL，復溶；復溶液用正己烷萃取2次（3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）3 min，棄上層正己烷，水層加0.025 mol·L－1氫氧化鈉溶液2.0 mL，混勻；再用乙醚萃取水層2次（3、3 mL），每次離心（3 500 r·min－1）3 min，合并乙醚萃取液，吹干；用流動相100 μL復溶，20 μL進樣。

2.5 標準曲線的制備

分別精密吸取標準含藥全血3.0 mL，按“2.4”項下方法操作，記錄色譜。以CsA濃度（c）對CsA與CsD峰面積比值（y）作線性回歸，得回歸方程：c＝411.71y+6.30（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，CsA濃度在50～1 550 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率及精密度試驗

分別精密吸取標準含藥全血3.0 mL，按“2.4”項下方法操作，分別于當日和連續(xù)6 d內(nèi)測定CsA濃度，計算回收率及日內(nèi)、日間RSD。另取上述含藥全血3.0 mL，同法測定，計算CsA與內(nèi)標CsD的峰面積比值Y1；取3.0 mL空白全血6份，按”2.4”項下方法操作，止于“用流動相100 μL復溶”前，在6支尖底試管中分別加CsA標準溶液50、100、200、400、800、1 500 μ L，吹干，用流動相100 μL復溶進樣，計算CsA與內(nèi)標CsD的峰面積比值Y2；計算CsA提取回收率（Y1/Y2×100%）?；厥章始熬芏仍囼灲Y(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision tests

2.7 穩(wěn)定性考察

取標準含藥全血分別于室溫存放0、6、24、72 h后測定CsA濃度，結(jié)果RSD＜6%（1.95%～5.98%，n＝6），表明樣本室溫存放72 h對CsA測定結(jié)果沒有影響（P＞0.05），即樣本在室溫存放72 h是穩(wěn)定的。

2.8 干擾試驗

將移植患者常用的藥物，如潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、氫化可的松、硫唑嘌呤、霉酚酸酯（驍悉）、地爾硫、硝苯地平、酮康唑、頭孢唑林、阿莫西林等加入空白全血中，使成適當濃度，按“2.4”項下方法操作，結(jié)果上述藥物均不干擾全血中CsA的分離與測定。

2.9 CsA全血濃度監(jiān)測

對79例移植患者413次全血濃度監(jiān)測，其中腎移植36例，肝移植26例，骨髓移植17例，年齡33～62歲。測得c2（858.17±410.98）ng·mL－1（n＝144），范圍為269.13～2 365.80 ng·mL－1，c0測得254.77±134.98 ng·mL－1（n＝269），范圍為38.13～785.60 ng·mL－1。

3 討論

乙醚對CsA萃取效率最高[1]，但分析純乙醚含有較多的過氧化物等雜質(zhì)，直接使用對色譜圖產(chǎn)生嚴重干擾，以致于使測定無法進行，且不同廠家和不同批次間存在差異，重蒸后雜峰消失，使色譜圖得以凈化，減少對色譜柱的污染[1，2]。因此，使用重蒸乙醚非常關(guān)鍵。

李海菊等[1]認為樣品中水的含量是影響CsA萃取回收率的主要因素，水含量越高，萃取回收率越低，故樣品處理時盡量少加含水的試液。如果對“2.4”項下含水試劑氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液的濃度進行優(yōu)化，減少使用體積，CsA提取回收率可能會更高。CsA不溶于正己烷，在酸性條件下用正己烷洗滌乙醚提取物，能夠去除乙醚提取物中脂溶性干擾物，純化樣品[3]。馮惠平等[4]發(fā)現(xiàn)隨鹽酸濃度的增大，正己烷的脫脂去除雜質(zhì)能力增強，色譜圖雜峰更少。

分析CsA血藥濃度的HPLC法絕大多數(shù)使用反相高效液相色譜法，常用色譜柱有C18、C8和氰基柱，氰基柱所需柱溫較低（55 ℃）[1]，C8柱次之（60 ℃），C18柱較高（60～72 ℃）[2～4]，方能獲得較好的柱效，但柱溫太高可加速色譜柱硅膠鍵合相的斷裂，使柱效下降，縮短色譜柱的壽命。筆者觀察了溫度對CsA和CsD色譜行為的影響，發(fā)現(xiàn)升高柱溫保留時間稍有減少，但峰形和分辨率改善有顯著意義，在55℃時就能獲得滿意的峰形和分辨率，且有利于色譜柱的保護，降低分析成本。然而，樣品上柱運行時間不能＜10 min，因為在8.4、9.6、12.3 min時各有一個內(nèi)源性雜質(zhì)峰，測定時應避開。

本法經(jīng)臨床79例移植患者413次全血CsA濃度監(jiān)測驗證，本法具有穩(wěn)定性好、線性范圍寬、柱溫低、靈敏準確、簡便快速的特點，非常適合臨床CsA治療藥物監(jiān)測和藥動學研究。

[1]李海菊，楊 娟，王 峰，等.RP-HPLC測定全血中環(huán)抱素A[J].中國藥學雜志，2005，40（11）：857.

[2]李碧峰，馮惠平，賈晉蓉，等.反相高效液相色譜法測定全血中環(huán)抱素的濃度[J].中國藥師，2007，10（7）：649.

[3]李 航，胡正波，魏志奇.反相高效液相色譜法測定環(huán)孢素A的血藥濃度[J].中國藥業(yè)，2009，18（15）：9.

[4]馮惠平，李碧峰，陳宜鋒，等.改良RP-HPLC測定全血中環(huán)孢素A的濃度[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2010，27（5）：433.